應(yīng)力環(huán)境下成骨細(xì)胞差異基因表達(dá)及選擇性剪接調(diào)控研究.pdf

1、生命有機(jī)體受應(yīng)力調(diào)節(jié)的生長一直是人們關(guān)注的問題。許多細(xì)胞都響應(yīng)力信號(hào)，包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等。應(yīng)力可能引起這些力效應(yīng)細(xì)胞在基因水平或表達(dá)水平的調(diào)控。由于細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)力信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)異常復(fù)雜的過程，一系列的基因、受體和通路都參與其中，因此需要通過基因組水平的檢測手段全面分析應(yīng)力信號(hào)的生物學(xué)功能和作用機(jī)制。本研究利用基因表達(dá)系列分析(Long SAGE)的方法檢測了應(yīng)力刺激前后成骨細(xì)胞內(nèi)的差異表達(dá)基因，并對(duì)這些基因進(jìn)

2、行了生物信息學(xué)分析，包括功能分析、基因本體論(Gene Ontology，GO)分析和信號(hào)通路分析，根據(jù)生物信息學(xué)的研究結(jié)果構(gòu)建了成骨細(xì)胞力信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　 應(yīng)力刺激能夠改變成骨細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)，其中一種可能的機(jī)制是應(yīng)力刺激對(duì)選擇性剪接的調(diào)控。真核生物的基因表達(dá)需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后的修飾，才能產(chǎn)生成熟的mRNA進(jìn)入胞漿，選擇性剪接是轉(zhuǎn)錄后修飾的一種重要手段。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)的檢測手段(實(shí)時(shí)定量PCR)鑒定了參與選擇性剪接

3、應(yīng)力調(diào)控的剪接因子，檢測了過載拉伸前后剪接因子的表達(dá)水平。剪接因子調(diào)控剪接功能的發(fā)揮與其自身的磷酸化水平密切相關(guān)，本研究通過檢測過載拉伸前后剪接因子磷酸化激酶的表達(dá)，分析了參與選擇性剪接應(yīng)力調(diào)控的可能的磷酸化通路。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　 ①成骨細(xì)胞體外加載模型的構(gòu)建：成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定結(jié)果顯示，組織塊貼壁法獲取的成骨細(xì)胞形態(tài)良好具有成骨細(xì)胞的特征，可以用于后續(xù)試驗(yàn)：設(shè)計(jì)制作過載拉伸裝置，本裝置可以對(duì)成骨細(xì)胞施加大應(yīng)

4、變量的拉伸加載，加載后成骨細(xì)胞生長狀態(tài)良好，單次加載獲取細(xì)胞量大，能夠滿足基因組水平檢測的需要。
　　 ②對(duì)成骨細(xì)胞施加不同參數(shù)的過載拉伸刺激，檢測成骨細(xì)胞的生理行為：細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，過載拉伸能夠改變成骨細(xì)胞細(xì)胞周期分布，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖；ALP檢測結(jié)果顯示，過載拉伸能夠抑制成骨細(xì)胞的分化；成骨細(xì)胞內(nèi)鈣分泌檢測結(jié)果顯示，過載拉伸刺激能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化。
　　 ③對(duì)成骨細(xì)胞施加不同參數(shù)的過載拉伸刺激，檢測成骨細(xì)

5、胞內(nèi)特異性基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，過載拉伸能夠有效地調(diào)控成骨細(xì)胞的多種特異性基因的表達(dá)，從而對(duì)成骨細(xì)胞的生理行為，如增殖、分化和礦化進(jìn)行調(diào)控。
　　 ④應(yīng)用Long SAGE技術(shù)構(gòu)建過載拉伸前后成骨細(xì)胞基因表達(dá)文庫，對(duì)兩個(gè)文庫進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果顯示，過載拉伸刺激后成骨細(xì)胞內(nèi)顯著上調(diào)的基因有100個(gè)，顯著下調(diào)的基因有72個(gè)，表明應(yīng)力刺激能夠有效地調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)。
　　 ⑤應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法對(duì)Long SAGE

6、文庫進(jìn)行可靠性驗(yàn)證。隨機(jī)選取的6個(gè)差異表達(dá)基因的PCR檢測結(jié)果與Long SAGE檢測結(jié)果一致，說明LongSAGE文庫提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是真實(shí)可靠的，可用于生物信息學(xué)分析。
　　 ⑥差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析：功能分析結(jié)果顯示，受應(yīng)力調(diào)控的差異表達(dá)基因主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的蛋白質(zhì)生物合成，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，代謝，離子結(jié)合，發(fā)育，凋亡，細(xì)胞粘附，細(xì)胞骨架，細(xì)胞增殖和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等功能；GO分析結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)基因具有不同的GO分類和功能，同時(shí)應(yīng)

7、力刺激也將通過調(diào)控這些差異表達(dá)基因來調(diào)控成骨細(xì)胞的各個(gè)生理過程和行為；KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因參與的三條最主要的通路分別是核糖體通路，細(xì)胞粘附通路和細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用通路。
　　 ⑦根據(jù)過載拉伸前后成骨細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果，構(gòu)建了一個(gè)完整的、系統(tǒng)的成骨細(xì)胞響應(yīng)細(xì)胞外應(yīng)力刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，即細(xì)胞通過胞外基質(zhì)感知應(yīng)力刺激，隨后激活與細(xì)胞膜結(jié)合的如整合素，鈣離子通道，DAG，Wnt，BMP-

8、6/TGF-β受體；導(dǎo)致與之相關(guān)的幾種信號(hào)通路被激活，包括ECM-整合素通路，肌動(dòng)蛋白通路，ERK1/2通路，BMP-6/TGF-β通路，Wnt通路，Ca2+調(diào)節(jié)通路和NO調(diào)節(jié)通路；最后這些力信號(hào)由細(xì)胞質(zhì)傳遞進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)與前mRNA剪接相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞外基質(zhì)組件，細(xì)胞骨架重組，成骨細(xì)胞增殖，分化和凋亡。
　　 ⑧選擇性剪接應(yīng)力調(diào)控機(jī)制分析：應(yīng)力調(diào)控剪接因子的鑒定，以SR蛋白(ASF/SF2和SC35)和hnRNP蛋白(h

9、nRNPA1)為研究對(duì)象，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR手段檢測過載拉伸前后兩類剪接因子的表達(dá)。結(jié)果顯示，應(yīng)力刺激對(duì)與選擇性剪接調(diào)控直接相關(guān)的兩類剪接因子SR蛋白和hnRNP蛋白都有顯著的調(diào)控作用，因此我們推測應(yīng)力刺激可能通過剪接因子的表達(dá)來調(diào)控成骨細(xì)胞的剪接變異體表達(dá)；參與選擇性剪接應(yīng)力調(diào)控的磷酸化通路分析，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測了參與選擇性剪接過程中SR蛋白磷酸化和去磷酸化相關(guān)的激酶的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)起作用的SRPK激酶