壓應力作用下成骨細胞早期應答中相關信號通路機制初探.pdf

1、目的:
　　力在骨改建過程中起著十分重要的作用，例如骨在長期負重情況下骨密度增加，而在失重環(huán)境中長期生活骨密度會發(fā)生一定程度的降低，導致骨質(zhì)疏松。在口腔正畸臨床治療過程中，對骨施加壓力使牙齒發(fā)生移位;種植治療中通過漸進性負重促進骨小梁的形成都是利用力對骨改建的重要作用。體外實驗研究中，成骨細胞通過感知壓力作用，釋放出多種細胞因子以調(diào)節(jié)成骨細胞與破骨細胞功能;而眾多細胞因子的改變主要是通過細胞內(nèi)部生物信號系統(tǒng)來調(diào)節(jié)細胞功能。成骨細胞

2、受到機械應力刺激后產(chǎn)生調(diào)控成骨與破骨的效應，關聯(lián)相當復雜的生物力學信號通路，其中促絲裂原激活蛋白激酶MAPK和AKT信號轉(zhuǎn)導通路是細胞內(nèi)部傳遞生物信號的重要途徑，國內(nèi)外已有大量實驗證實MAPK和AKT信號通路中相關蛋白能夠被機械刺激激活并調(diào)節(jié)成骨細胞功能。細胞內(nèi)信號通路涉及的蛋白質(zhì)眾多，當細胞受到壓應力刺激時這些信號通路是如何調(diào)節(jié)骨改建功能，其中的反應十分復雜。在不同加壓條件下哪些蛋白酶被壓應力刺激激活發(fā)揮作用，對機械力產(chǎn)生早期應答反應

3、，從而導致不同的成骨或破骨效應，目前尚無實驗進一步研究證實。因此本實驗通過對三維培養(yǎng)的成骨細胞施加不同的壓應力條件，采用磷酸化蛋白芯片技術檢測相關蛋白因子磷酸化表達水平，以探討壓應力作用下細胞內(nèi)相關信號通路激活情況。從而探究不同壓應力作用下參與早期應答反應的相關信號通路，并篩選出壓應力刺激早期應答中參與調(diào)控成骨細胞功能的關鍵信號因子。
　　方法:
　　1.制作細胞培養(yǎng)和壓應力加載裝置，利用本實驗組自行制作的藻酸鈣凝膠培養(yǎng)孔作

4、為成骨細胞培養(yǎng)及加壓裝置;采用鼠尾Ⅰ型膠原作為成骨細胞的三維培養(yǎng)基質(zhì)。分別對成骨細胞施加2g/cm2、5g/cm2的壓應力，持續(xù)加壓6h，以不加力組（稱為0g/cm2組）作為對照組。將加壓后的細胞膠原，經(jīng)羅丹明標記鬼筆環(huán)肽染色后共聚焦顯微鏡下觀察細胞三維培養(yǎng)形態(tài)，采用CCK8法檢測3組細胞的活性。
　　2.對成骨細胞分別施加不同時間的壓力，實驗組為2g/cm2、5g/cm2，對照組0g/cm2，分別持續(xù)加壓45min、3h和6h。

5、應用磷酸化蛋白芯片技術，檢測不同壓應力條件下MAPK以及AKT信號轉(zhuǎn)導通路中相關蛋白磷酸化的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.對成骨細胞施加2g/cm2、5g/cm2壓應力作用6h后，通過羅丹明標記鬼筆環(huán)肽對成骨細胞MC3T3-E1的肌動蛋白染色，共聚焦熒光顯微鏡下觀察，細胞附著點成立體分布于細胞培養(yǎng)基質(zhì)中;采用CCK8法檢測細胞活性，結(jié)果顯示3組間的OD值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　2.持續(xù)施力6h時2g/

6、cm2壓應力CREB、AKT、HSP27、GSK3α、GSK3β、JNK、MSK2、p38、p53、p70s6k、ERK1/2磷酸化蛋白表達水平明顯高于對照組(P＜0.05);5g/cm2壓應力時CREB、MSK2、p38、p53、p70s6k、ERK1/2磷酸化蛋白表達水平顯著高于對照組(P＜0.05);5g/cm2時AKT、GSK3β與HSP27的磷酸化蛋白表達量明顯低于2g/cm2組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2g/cm

7、2組持續(xù)作用45min和3h時，各蛋白磷酸化表達水平與對照組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。壓應力為5g/cm2時，持續(xù)作用45min，p70s6k磷酸化蛋白表達水平明顯高于對照組(P=0.038＜0.05);RSK1在5g/cm2組磷酸化蛋白表達水平顯著低于對照組(P=0.019＜0.05)。5g/cm2持續(xù)作用3h時HSP27、p70s6k和RSK2的磷酸化蛋白表達水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);其他磷

8、酸化蛋白表達水平與對照組間差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.本實驗設計的壓應力加壓裝置及實驗條件能夠維持成骨細胞三維培養(yǎng)形態(tài)，壓應力加載條件不會影響成骨細胞活性。成功建立的壓應力加載模型，可作為壓應力相關研究的實驗平臺。
　　2.細胞持續(xù)加壓6h是相關信號通路對壓應力產(chǎn)生早期應答反應的關鍵時間點。
　　3.壓應力作用下成骨細胞早期應答反應中相關信號通路的激活與壓應力的大小有關。壓應力分別持