ERK5信號通路在雌激素抑制TNF-α誘導(dǎo)成骨細胞凋亡中的作用及機制的實驗研究.pdf

1、目的：雌激素缺乏與骨量丟失密切相關(guān)，且能影響骨組織的力學(xué)響應(yīng)能力。雌激素骨保護作用的具體機制尚不十分明確，對這一機制的研究有助于揭示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制，并為其治療提供新思路、新靶點。本課題以ERK5分子為核心，研究雌激素抑制成骨細胞凋亡的相關(guān)機制，結(jié)果將為骨量減少性疾病治療藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴體內(nèi)實驗：隨機將15只6周齡（性成熟）的雌性昆明小鼠分為5組，每組3只，隨機選取4組行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)，另外一組行假

2、手術(shù)并作為對照。術(shù)后3天開始給予不同藥物干預(yù)，對照組平行喂養(yǎng)，切除卵巢的4組中，一組平行喂養(yǎng)，一組每日按50mg/kg體重的劑量腹腔注射ERK5特異性阻斷劑XMD8-92一次，一組每日按5mg/kg體重的劑量皮下注射17β-雌二醇一次，一組每日分別按50mg/kg、5mg/kg體重的劑量腹腔注射 XMD8-92并皮下注射17β-雌二醇各一次，每周行雙能 X線骨密度檢查監(jiān)測股骨骨密度的變化情況，當單純摘除卵巢組骨密度下降至與初始值相比較差

3、異有統(tǒng)計學(xué)意義時終止實驗，麻醉下頸椎脫臼法處死小鼠收集股骨標本，每組樣本經(jīng)固定后對股骨遠端干骺端部位分別行Micro-CT掃描和組織學(xué)檢查。⑵體外實驗：首先對體外培養(yǎng)的小鼠源性MC3T3-E1成骨細胞分別孵育不同時間和不同濃度的17β-雌二醇，通過Western-Blot研究雌激素活化ERK5的規(guī)律，明確最佳激活濃度及時間。再通過流式細胞術(shù)、Hoechst33258染色及TUNEL/DAPI復(fù)染研究不同干預(yù)條件下成骨細胞的凋亡情況，明確

4、 ERK5在成骨細胞凋亡調(diào)節(jié)中的作用。最后通過Western-Blot及酶標儀檢測不同干預(yù)條件下成骨細胞凋亡蛋白表達量的差異，明確ERK5在成骨細胞凋亡調(diào)節(jié)中的具體作用機制。
　　結(jié)果：①體內(nèi)實驗：骨密度監(jiān)測結(jié)果顯示，在最初的一段時間內(nèi)，各組骨密度變化均不明顯，各組間也沒有明顯差異。隨著時間的推移和用藥的繼續(xù)，各組小鼠骨密度開始出現(xiàn)較明顯的變化趨勢，組間差異也逐漸變得明確。8周后終止實驗，單純摘除卵巢組小鼠骨密度較初始值及對照組分

5、別降低38.07％和37.06%；而切除卵巢后腹腔注射ERK5特異性阻斷劑XMD8-92組小鼠骨密度較對照組降低47.89%，更較單純摘除卵巢組小鼠骨密度低17.21%；切除卵巢后外源性補充雌激素組小鼠骨密度較單純摘除卵巢組小鼠骨密度增高151.78%，甚至比對照組小鼠骨密度增加55.92%；摘除卵巢后先注射XMD8-92阻斷ERK5活化再外源性補充雌激素組小鼠骨密度較單純外源性補充雌激素組降低32.45%。Micro-CT掃描及三維重

6、建結(jié)果顯示，同對照組相比，切除卵巢后小鼠骨小梁體積、數(shù)目及厚度分別減少30.45%、42.30%和17.81%，小梁間隙增寬35.89%；卵巢切除后與ERK5特異性阻斷劑XMD8-92聯(lián)合干預(yù)下小鼠骨小梁數(shù)目更少，體積及厚度也更小，小梁間隙更寬；卵巢切除后給予外源性補充17β-雌二醇組骨小梁體積、數(shù)目及厚度分別較單純摘除卵巢組增加310.50%、196.91%和323.39%，小梁間隙減少81.95%；而在卵巢切除同時給予XMD8-92

7、和雌激素干預(yù)組小鼠骨小梁體積、數(shù)目及厚度較單獨給予雌激素干預(yù)時分別減少62.42%、38.71%和65.55%，小梁間隙增加185.20%。HE染色結(jié)果與骨密度監(jiān)測及Micro-CT掃描結(jié)果一致。②體外實驗：對小鼠源性 MC3T3-E1成骨細胞孵育10（-6）mol/L的17β-雌二醇，隨孵育時間延長，ERK5活化水平增加，在15min時達到高峰（77.80±7.70%），之后迅速降低；用不同濃度的17β-雌二醇（10（-9）-10（-

8、5） mol/L）分別孵育成骨細胞15min，發(fā)現(xiàn)ERK5活化水平隨17β-雌二醇濃度的增加而增加，在10（-6）mol/L已達高峰（52.16±8.87%）；5umol/L的XMD8-92孵育1h能有效阻斷ERK5的磷酸化。流式細胞術(shù)計數(shù)結(jié)果顯示，40ng/ml的TNF-α能有效誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細胞發(fā)生凋亡(49.10±5.29%)，10（-6）mol/L的17β-雌二醇孵育15min有效刺激 ERK5活化并顯著降低 TNF-

9、α誘導(dǎo)的凋亡率（14.51±3.04%），XMD8-92阻斷雌激素對ERK5的活化后TNF-α誘導(dǎo)的凋亡率升至48.29±6.33%。Hoechst33258染色及TUNEL/DAPI復(fù)染結(jié)果類似。進一步的Western-Blot及酶標儀檢測結(jié)果顯示，TNF-α作用下成骨細胞Bax表達增加，Bcl-2表達減少，Bax/Bcl-2比例增加，Caspase3活性增加；17β-雌二醇預(yù)處理刺激ERK5活化后Bax表達減少，Bcl-2表達增加，

10、Bax/Bcl-2比例減小，Caspase3活性降低；XMD8-92阻斷雌激素對ERK5的活化后Bax表達增加，Bcl-2表達減少，Bax/Bcl-2比例增加，Caspase3活性增加。
　　結(jié)論：⑴ERK5信號通路參與雌激素的骨保護作用，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；⑵雌激素以時間、濃度依賴的方式激活成骨細胞內(nèi)ERK5后，通過上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)Bax表達，增加Bcl-2/Bax比例，進而抑制Caspase級聯(lián)反應(yīng)，抑制T