跨膜型TNF-α正向與反向信號(hào)在活化誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制.pdf

1、TNF-α(tumornecrosisfactor,TNF-α)是由激活的單核/巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等分泌的具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它能直接介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死，參與機(jī)體局部及全身炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)免疫細(xì)胞的增殖分化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在體內(nèi)以兩種形式存在：即26kD的跨膜型TNF-α(membraneassociatedTNF-α，mTNF-α)和17kD的分泌型TNF-α(secretedTNF-α，sTNF-α)，后者由mTN

2、F-α酶解而來。兩型TNF-α通過與兩型TNF受體(TNFR1與TNFR2)結(jié)合而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用。 成熟T細(xì)胞的AICD是機(jī)體清除免疫應(yīng)答中過量的效應(yīng)T細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，維持免疫穩(wěn)態(tài)和建立外周免疫耐受的重要機(jī)制。目前，已證實(shí)FasL/Fas是介導(dǎo)T細(xì)胞AICD重要的、但非唯一的死亡分子。關(guān)于TNF-α在AICD的作用主要限制于對sTNF-α的研究，mTNF-α正向信號(hào)在AICD中的作用則未見報(bào)道。 近來研究發(fā)現(xiàn)，

3、mTNF-α除了作為配體可與TNFR結(jié)合，向靶細(xì)胞傳遞正向信號(hào)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)外，還可同時(shí)作為受體向效應(yīng)細(xì)胞傳遞反向信號(hào)(reversesignaling)。有學(xué)者報(bào)道Infliximab可以誘發(fā)Crohn's病患者腸相關(guān)淋巴組織固有層(laminapropria)T細(xì)胞凋亡及外周血活化的T細(xì)胞凋亡。提示mTNF-α的反向信號(hào)可以參與AICD。 本課題以PHA活化白血病CD4+淋巴細(xì)胞系Jurkat建立體外的AICD模型，研究和

4、比較mTNF-α和sTNF-α對T細(xì)胞AICD的影響，以期闡明兩型TNF-α正向信號(hào)及mTNF-α的反向信號(hào)在AICD中的生物學(xué)特征及生物學(xué)作用，從而深入探討AICD的分子機(jī)制，為臨床治療自身免疫病提供新的線索。 一、AICD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?1.PHA誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞AICD的劑量依賴性 體外以不同劑量的PHA刺激Jurkat細(xì)胞24h，借助Annexin/PI法觀察AICD。結(jié)果顯示，PHA可誘導(dǎo)Jurka

5、t細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈劑量依賴性，即凋亡率隨PHA的濃度的遞增而升高，當(dāng)PHA為1μg/ml時(shí)其凋亡率已達(dá)50％，5μg/ml為63％，20μg/ml則超過80％。 2.PHA誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞AICD的時(shí)間動(dòng)力學(xué) 選取5μg/ml的PHA，觀察其誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞AICD的時(shí)間動(dòng)力學(xué)。凋亡在2h時(shí)已達(dá)22％，6h已升高至56％，隨著PHA刺激時(shí)間的延長，其凋亡率緩慢上升，24h時(shí)凋亡率為63％，而72h時(shí)則達(dá)82％。

6、選取PHA既可有效誘導(dǎo)AICD，凋亡值又適中的劑量(5μg/ml)和作用時(shí)間點(diǎn)(24h)作為誘導(dǎo)體外AICD模型的條件。 3.TNF-α參與PHA誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的AICD 用本實(shí)驗(yàn)室制備的對mTNF-α無反向信號(hào)作用的抗TNF-α單克隆抗體中和內(nèi)源性TNF-α，可部分抑制PHA誘導(dǎo)的AICD(抑制率14.01％，p＜0.05)，提示TNF-α參與PHA誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的AICD。 二、mTNF-α和sT

7、NF-α正向信號(hào)在AICD中的作用 1.mTNF-α正向信號(hào)在AICD中的作用 1.1AICD中Jurkat細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性mTNF-α 實(shí)驗(yàn)證實(shí)未刺激的Jurkat表達(dá)少量mTNF-α(4.5％)，PHA活化的T細(xì)胞表達(dá)mTNF-α明顯增加，并隨著刺激時(shí)間的延長而逐漸增高。24h時(shí)mTNF-α的表達(dá)率為45.8％。 1.2mTNF-α對未活化Jurkat的殺傷作用 用1％多聚甲醛固定PHA活化24

8、h的Jurkat細(xì)胞，以不同的效靶比與未活化的Jurkat細(xì)胞共同孵育24h，借助WST-1法檢測活化T細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果顯示活化T細(xì)胞對未活化細(xì)胞具有明顯的殺傷作用，且隨效靶比的升高而增強(qiáng)，5∶1時(shí)殺傷率為71％。應(yīng)用兔抗人TNF多克隆抗體(TNFpAb)及鼠抗人sTNF-α單克隆抗體(TNFmAb)，可部分阻斷其殺傷作用(抑制率分別為53.86％和43.37％，p＜0.01)，提示活化T細(xì)胞的殺傷作用部分是由mTNF-α介導(dǎo)的。

9、 1.3mTNF-α對活化Jurkat的殺傷作用 用多聚賴氨酸使將PHA活化24h的Jurkat細(xì)胞貼壁，以效靶比5∶1加入PHA活化2h的Jurkat細(xì)胞(作為靶細(xì)胞)共同孵育48h。結(jié)果顯示，活化Jurkat細(xì)胞對活化Jurkat細(xì)胞有明顯致凋亡作用(44.37％，p＜0.01)，且抗TNFpAb和mAb可以部分阻斷AICD(p＜0.01)。提示mTNF-α可能是AICD的效應(yīng)分子之一。 2.sTNF-α正向信

10、號(hào)在AICD中的作用 2.1活化Jurkat細(xì)胞分泌內(nèi)源性sTNF-α 收集PHA作用24小時(shí)的Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)上清，以ELISA法未能檢出sTNF-α的分泌。 2.2PHA誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞表達(dá)TACE 進(jìn)一步觀察TNF轉(zhuǎn)換酶(TACE)的表達(dá)是否受到抑制，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示PHA可以明顯刺激Jurkat細(xì)胞表達(dá)TACE(表達(dá)率44.39％)。推測TACE可能導(dǎo)致大量可溶性TNFR的產(chǎn)生，從而影響

11、sTNF-α的免疫學(xué)檢測。 2.3外源性sTNF-α在AICD中的作用 為探索sTNF-α對T細(xì)胞是否具有致凋亡作用，用外源性sTNF-α(50U/ml)作用Jurkat細(xì)胞24h，結(jié)果顯示sTNF-α可殺傷未活化(凋亡率23.81％，p＜0.01)和活化Jurkat細(xì)胞(凋亡率78.13％，p＜0.01)。 三、mTNF-α反向信號(hào)在AICD中的作用 1.mTNF-α反向信號(hào)促進(jìn)PHA誘導(dǎo)的AICD

12、 1.1抗TNF-α多克隆抗體可促進(jìn)PHA誘導(dǎo)的AICD 用抗TNF-α多克隆抗體激活mTNF-α反向信號(hào)，結(jié)果顯示，其不能誘導(dǎo)未活化Jurkat細(xì)胞發(fā)生凋亡，但可明顯提高活化Jurkat細(xì)胞的凋亡率，增強(qiáng)率為20.11％(p＜0.01)。提示mTNF-α反向信號(hào)可增強(qiáng)AICD效應(yīng)。 1.2sTNFR1也可促進(jìn)AICD 為進(jìn)一步確認(rèn)mTNF-α反向信號(hào)促進(jìn)AICD的效應(yīng)，我們用可溶性TNFRI(sTNFR12

13、0μg/ml)刺激mTNF-α反向信號(hào)，結(jié)果sTNFR1不能誘導(dǎo)未活化的Jurkat細(xì)胞凋亡，但可明顯提高活化Jurkat細(xì)胞的凋亡率(凋亡率86.82％)，且呈劑量依賴性(p＜0.01)。提示mTNF-α反向信號(hào)確可促進(jìn)AICD。 2.mTNF-α反向信號(hào)增強(qiáng)AICD的機(jī)制 2.1mTNF-α反向信號(hào)促進(jìn)PHA誘導(dǎo)的Fas和FasL的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)證實(shí)未經(jīng)活化的Jurkat細(xì)胞低表達(dá)Fas/FasL；PHA可誘導(dǎo)J

14、urkat細(xì)胞表達(dá)Fas(33.28％)和FasL(34.98％)。用抗TNF-α多克隆抗體激活mTNF-α反向信號(hào)，可明顯促進(jìn)PHA誘導(dǎo)的Fas(52.19％)和FasL(47.74％)的表達(dá)(p＜0.01)，其增強(qiáng)率分別為56.82％，36.47％。 2.2mTNF-α反向信號(hào)促進(jìn)PHA誘導(dǎo)的mTNF-α表達(dá) 實(shí)驗(yàn)證實(shí)未活化Jurkat細(xì)胞低表達(dá)mTNF-α，PHA誘導(dǎo)其表達(dá)增加(45.51％)，而mTNF-α反向信

15、號(hào)則可促進(jìn)PHA誘導(dǎo)的mTNF-α表達(dá)率增至61.15％，與PHA刺激組相比，增強(qiáng)率為34.36％(p＜0.01)。 2.3mTNF-α反向信號(hào)促凋亡中TNFR1和TNFR2的變化 實(shí)驗(yàn)證實(shí)未活化Jurkat細(xì)胞低表達(dá)TNFR1和TNFR2，PHA主要誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞表達(dá)TNFR1(45.29％)，而TNFR2表達(dá)則輕度上升(僅6.54％)，提示TNF-α在PHA誘導(dǎo)的AICD中主要通過含有死亡結(jié)構(gòu)域的TNFR1介導(dǎo)

16、凋亡。mTNF-α反向信號(hào)可明顯上調(diào)TNFR1(59.32％％)和TNFR2的表達(dá)(55.66％，p＜0.01)。結(jié)論：上述結(jié)果提示①mTNF-α可能為AICD的效應(yīng)分子之一，其正向和反向信號(hào)均參與AICD。②PHA主要誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞表達(dá)TNFR1，提示TNF-α主要通過含有死亡結(jié)構(gòu)域的TNFR1介導(dǎo)凋亡。③mTNF-α反向信號(hào)促進(jìn)PHA誘導(dǎo)AICD的主要分子機(jī)制：上調(diào)Fas和FasL、mTNF-α、TNFR1和TNFR2的表達(dá)。