RNA干擾對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-α的影響.pdf

1、目的：腫瘤壞死因子(tumornectosisfactor-α，TNF-α)由活化的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是一類重要的細(xì)胞因子，TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性。最初對(duì)TNF-α功能的認(rèn)識(shí)僅限于對(duì)腫瘤特異性殺傷作用，后來發(fā)現(xiàn)TNF-α也具有免疫調(diào)節(jié)作用，而且參與某些炎癥反應(yīng)過程。適量的TNF-α可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)部的穩(wěn)定狀態(tài)及抵御各種致病因子具有重要意義，然而，TNF-α的異常分泌可作為機(jī)體炎癥、損傷及休克的重要介質(zhì)。

2、目前已知與TNF-α有關(guān)的疾病包括：AIDS、貧血、自身免疫性疾病、腫瘤、出血性休克、移植排斥反應(yīng)、結(jié)核病、白血病、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。TNF-α參與了眾多疾病的發(fā)生發(fā)展過程，因此，在不同水平上阻斷TNF-α的作用，有可能對(duì)與TNF-α有關(guān)的疾病產(chǎn)生治療作用。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是利用具有同源性互補(bǔ)序列的雙鏈RNA誘發(fā)序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，它可以通過抑制蛋白表達(dá)來模擬基因敲除技術(shù)，RNA

3、干擾在植物、真菌及動(dòng)物細(xì)胞中均存在，在抗腫瘤、抗病毒及研究基因功能等方面都有著廣泛的應(yīng)用前景。抑制效果有明顯的高效性、特異性。本實(shí)驗(yàn)利用SilentgeneTMU6試劑盒在體外經(jīng)PCR合成siRNA表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄出siRNA引發(fā)干擾。針對(duì)小鼠TNF-α基因選取2個(gè)靶位點(diǎn)，測定并比較其干擾效果，從而選出敏感的抑制位點(diǎn)，為今后克隆質(zhì)粒提供最強(qiáng)的干擾序列。本文就位點(diǎn)1干擾作用加以論述。 方法：1.小鼠脾淋巴細(xì)胞

4、的培養(yǎng)：C57BL/6小鼠，雄性(中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供)，頸椎脫臼法處死，0℃無菌條件下取脾，尼龍網(wǎng)上研磨，過濾制成細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分層液分離脾淋巴細(xì)胞，完全DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，1×105個(gè)/ml，接種96孔板。 2.淋巴細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生能力的檢測：細(xì)胞正常生長后，每孔加10μg/mlLPS，10μl/孔，作用6小時(shí)后，去除刺激，分別于終止刺激24h、36h、48h、60h取出細(xì)胞培養(yǎng)液上清，測TNF-α濃度。

5、 3.實(shí)驗(yàn)分組：共分4組，干擾組：給予針對(duì)TNF-α位點(diǎn)1的siRNA表達(dá)載體。陽性對(duì)照組：給予針對(duì)非同源siRNA表達(dá)載體，這里選擇的是靶向IL-1某一位點(diǎn)的序列。陰性對(duì)照組：給予正常DMEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染對(duì)照組：給予表達(dá)GFP的pEGFP-N1質(zhì)粒。前3組收集細(xì)胞上清，用ELISA方法檢測TNF-α、IL-1的分泌量。轉(zhuǎn)染對(duì)照組用熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)。 4.干擾組及陽性對(duì)照組siRNA表達(dá)載體的獲得及檢測：從Gen

6、eBank中查找C57BL/6小鼠TNF-α、IL-1的序列。根據(jù)靶序列篩選原則及pro-mega公司siRNAtargetDisigner設(shè)計(jì)軟件，經(jīng)BLAST對(duì)比后，選擇出編碼靶標(biāo)RNA的基因序列，由上海生工公司合成干擾組及陽性對(duì)照組下游引物，利用SilentgeneTMU6試劑盒經(jīng)PCR反應(yīng)合成siRNA表達(dá)載體，純化后，用2％瓊脂糖凝膠電泳分析。 5.RNA干擾作用特異性的測定：IL-1為淋巴細(xì)胞分泌的又一重要的細(xì)胞因子

7、，將其作為陽性對(duì)照，分泌受到了抑制，可說明RNAi作用特異性。 6.轉(zhuǎn)染對(duì)照組所需pEGFP-N1質(zhì)粒的制備及轉(zhuǎn)染：經(jīng)典方法擴(kuò)增pEGFP-N1質(zhì)粒，堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，純化后轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞。 7.干擾：獲取淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)正常生長后，每組分別給予對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑，干擾組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，檢測TNF-α、IL-1濃度，轉(zhuǎn)染對(duì)照組在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況。 8.細(xì)胞因子的檢測：用

8、ELISA方法檢測TNF-α、IL-1的分泌情況，操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。 結(jié)果：1.LPS刺激淋巴細(xì)胞分泌TNF-α的動(dòng)態(tài)變化：LPS停止刺激24小時(shí)起，TNF-α的分泌開始上升，48小時(shí)達(dá)到高峰，48小時(shí)后開始下降。 2.干擾組及陽性對(duì)照組siRNA表達(dá)載體的獲得及檢測：干擾組下游引物，引物A序列：(將給出反義RNA)5'CAAAAACTGTAAAAA-GAGCACAGAAAGCATGATC-GGTGTTTCGTC

9、CTTTCCACAAGA3'引物B序列：(將給出有義RNA)5'CAAAAACTGTAAAAA-GATCATGCTTTCTGTGCTC-GGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA3'陽性對(duì)照組下游引物：引物A序列：(將給出反義RNA)5'CAAAAACTGTAAAAA-GCAAGCTATGGCTCACTTC-GGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA3'引物B序列：(將給出有義RNA)5'CAAAAACTGTAAAAA-GAAG

10、TGAGCCATAGCTTGC-GGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA3'下游引物合成后，利用SilentgeneTMU6試劑盒經(jīng)PCR反應(yīng)合成siRNA表達(dá)載體。 2％瓊脂糖電泳檢測純化后的PCR產(chǎn)物(見圖4)3.RNA干擾作用對(duì)TNF-α濃度的影響：干擾組TNF-α分泌量較陽性對(duì)照組及陰性對(duì)照組均明顯降低。P＜0.05。 4.RNA干擾作用序列特異性：陽性對(duì)照組IL-1分泌量較干擾組及陰性對(duì)照組均明顯降低。P

11、＜0.05。 5.pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果的觀察：熒光顯微鏡下可見細(xì)胞發(fā)出翠綠色熒光。 結(jié)論：1.RNA干擾可以有效的抑制原代培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞TNF-α的分泌。 2.RNA干擾有嚴(yán)格的序列特異性。 3.針對(duì)位點(diǎn)1的干擾作用可以抑制小鼠脾淋巴TNF-α的分泌，該位點(diǎn)可以作為今后克隆質(zhì)粒研究的敏感位點(diǎn)。 總之，RNA干擾特異性抑制了哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞TNF-α的分泌，為TNF-α相關(guān)疾病在基因水