異種抗原免疫及瘤內(nèi)注射對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫功能影響的研究.pdf

1、機(jī)體免疫系統(tǒng)具有一定的識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞的能力已被許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗腫瘤免疫效應(yīng)一般以細(xì)胞免疫為主，尤其是特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）的殺傷活性在機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)中起關(guān)鍵作用。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）是目前已知體內(nèi)抗原呈遞功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞（APC），CTL殺傷腫瘤細(xì)胞依賴于APC遞呈腫瘤抗原。但由于腫瘤的低免疫原性以及機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受，使得腫瘤免疫治療受到限制。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤局部微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)，其內(nèi)的細(xì)胞免疫亦存在著一個(gè)復(fù)雜的

2、調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。在腫瘤患者體內(nèi)，DC處于失活狀態(tài)，表現(xiàn)為數(shù)量減少及表型和功能上的缺陷。腫瘤患者的免疫系統(tǒng)無(wú)法識(shí)別、殺傷腫瘤細(xì)胞，主要是由于患者體內(nèi)的DC功能有缺陷，不能實(shí)現(xiàn)DC在免疫反應(yīng)過(guò)程中有效呈遞腫瘤抗原的作用。因此如何通過(guò)免疫治療，打破免疫耐受，改善腫瘤局部免疫抑制環(huán)境，促進(jìn)DC細(xì)胞遞呈腫瘤抗原，有助于誘導(dǎo)CTL特異性殺傷腫瘤細(xì)胞活性。 目的: 利用異種抗原免疫及瘤內(nèi)注射的方法來(lái)治療腫瘤，將抗異種抗原免疫反應(yīng)和二次免疫應(yīng)

3、答引入腫瘤局部。通過(guò)計(jì)算脾指數(shù)、胸腺指數(shù)，測(cè)定脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的體外殺傷率及利用免疫組化分析脾組織的CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化，主要來(lái)了解不同處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞的免疫功能，進(jìn)而從脾免疫細(xì)胞的角度來(lái)驗(yàn)證此方法的可行性，并探索其機(jī)理。 方法: 1、利用兩種異種抗原：滅活鏈球菌（α-溶血性鏈球菌經(jīng)60Co機(jī)照射24小時(shí)滅活）、血型抗原（含有A型血型抗原的人A型紅細(xì)胞膜成分）進(jìn)行研究。 2、試驗(yàn)動(dòng)

4、物分組：滅活鏈球菌實(shí)驗(yàn)包括4個(gè)小組：A、滅活鏈球菌全身免疫及瘤內(nèi)注射組；B、滅活鏈球菌僅全身免疫組；C、滅活鏈球菌僅瘤內(nèi)注射組；D、空白對(duì)照組。血型抗原實(shí)驗(yàn)也包括4個(gè)小組：a、血型抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組；b、血型抗原僅全身免疫組；c、血型抗原僅瘤內(nèi)注射組；d、空白對(duì)照組。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)共8個(gè)小組，由于空白對(duì)照組D和d可以共用，因此兩個(gè)實(shí)驗(yàn)可分為7個(gè)小組，每組6只，實(shí)驗(yàn)共需昆明小鼠42只。 3造模過(guò)程：前兩周小鼠全身免疫4次，2次/周

5、（A、B組小鼠每次腹腔注射濃度為0.1g/ml的滅活鏈球菌0.1ml/只；a、b組小鼠每次腹腔注射濃度為5mg/ml的血型抗原0.1ml/只；同時(shí)C、D、c、d組小鼠每次腹腔注射生理鹽水0.1ml/只）。然后于各組小鼠背部皮下接種濃度為1×107個(gè)/ml的S180細(xì)胞0.1ml/只，約兩周長(zhǎng)成大小為1cm3左右的腫塊，隨后連續(xù)5天瘤內(nèi)注射異種抗原（A、C組小鼠每天瘤內(nèi)注射濃度為0.1g/ml的滅活鏈球菌0.1ml/只；a、c組小鼠每天瘤

6、內(nèi)注射濃度為5mg/ml的血型抗原0.1ml/只；同時(shí)B、D、b、d組小鼠每天瘤內(nèi)注射生理鹽水0.1ml/只）。瘤內(nèi)注射結(jié)束5天后，處死小鼠。 4、取脾及胸腺，計(jì)算脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。 5、脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷活性測(cè)定：效靶比=20：1，在體外用MTT比色法測(cè)定不同處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的體外殺傷活性。 6、脾組織免疫組化分析CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化：切脾后立即取脾組織塊，常規(guī)

7、固定、石蠟包埋、切片，行PAP法免疫組織化學(xué)染色，染色后高倍鏡（10×40倍）下，分別計(jì)算每張切片中CD4、CD8陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。 7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：全部資料結(jié)果以（x±S）表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)的4個(gè)小組進(jìn)行析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，有交互效應(yīng)的固定一因素對(duì)另一因素的兩水平進(jìn)行t檢驗(yàn)，最后進(jìn)行單因素方差分析找出最佳組合。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)之間單獨(dú)兩組樣本的均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平：取a=0.05。

8、 結(jié)果: 1、滅活鏈球菌實(shí)驗(yàn) （1）A、B、C和D組小鼠的胸腺指數(shù)分別為：2.50±1.07mg/g、1.67±0.37mg/g、2.33±1.04mg/g和2.25±0.91mg/g。滅活鏈球菌全身免疫與否和瘤內(nèi)注射與否對(duì)胸腺指數(shù)均無(wú)顯著性影響（F=0.328，P=0.573和 F=1.585，P=0.223），滅活鏈球菌全身免疫與瘤內(nèi)注射無(wú)交互效應(yīng)（F=1.061，P=0.315）。四組小鼠的胸腺指數(shù)無(wú)顯著性差異（F

9、=0.991，P=0.417）。 （2）A、B、C和D組小鼠的脾指數(shù)分別為：14.42±2.63mg/g、15.83±2.28mg/g、15.28±4.51mg/g和5.67±1.31mg/g。滅活鏈球菌全身免疫與否和瘤內(nèi)注射與否對(duì)小鼠的脾指數(shù)均有顯著性影響（F=15.163，P=0.001和F=11.788，P=0.003），滅活鏈球菌全身免疫與瘤內(nèi)注射有交互效應(yīng)（F=21.342，P=0.000）。在全身免疫時(shí)瘤內(nèi)注射與否對(duì)

10、脾指數(shù)無(wú)顯著性影響（t=0.995，P=0.343），無(wú)全身免疫時(shí)瘤內(nèi)注射可提高脾指數(shù)（t=5.014，P=0.001）。在瘤內(nèi)注射時(shí)全身免疫與否對(duì)脾指數(shù)也無(wú)顯著性影響（t=0.406，P=0.693），無(wú)瘤內(nèi)注射時(shí)全身免疫可提高脾指數(shù)（t=9.449，P=0.000）。四組小鼠的脾指數(shù)有顯著性差異（F=16.097，P=0.000），A、B和C組的脾指數(shù)均高于D組（P值均<0.05）。 （3）在效靶比20：1時(shí)，A、B、C和D

11、組的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷率分別為：63.17%±3.94%、10.26%±1.95%、33.30%±3.82%和9.85%±2.76%。滅活鏈球菌全身免疫與否和瘤內(nèi)注射與否對(duì)殺傷率均有顯著性影響（F=132.499，P=0.000和F=842.219，P=0.000），滅活鏈球菌全身免疫與瘤內(nèi)注射有交互效應(yīng)（F=125.308，P=0.000）。無(wú)論有無(wú)全身免疫瘤內(nèi)注射均可提高殺傷率（t=29.455，P=0.000和t=

12、12.198，P=0.000），在瘤內(nèi)注射時(shí)全身免疫可提高殺傷率（t=13.330，P=0.000），無(wú)瘤內(nèi)注射時(shí)全身免疫與否對(duì)殺傷率無(wú)顯著性影響（t=0.302，P=0.769）。四組的殺傷率有顯著差異（F=366.675，P=0.000），其中A組的殺傷率最高。 2、血型抗原實(shí)驗(yàn) 3、滅活鏈球菌殺傷實(shí)驗(yàn)與血型抗原殺傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比較 結(jié)論: 1、異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射或僅全身免疫或僅瘤內(nèi)注射，小鼠的

13、胸腺指數(shù)均無(wú)提高。 2、異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射或僅全身免疫或僅瘤內(nèi)注射，小鼠的脾指數(shù)均有提高，即提高了小鼠的整體免疫功能。 3、異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射或僅瘤內(nèi)注射顯著提高了小鼠脾淋巴細(xì)胞殺傷S180細(xì)胞的功能，而異種抗原僅全身免疫對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞殺傷S180細(xì)胞的功能卻無(wú)提高。 4、血型抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射或僅全身免疫或僅瘤內(nèi)注射均能提高小鼠脾臟的CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)。同時(shí)血型抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射或僅