聯(lián)體共生模型對荷瘤小鼠腫瘤免疫的影響.pdf

1、聯(lián)體共生(parabiosis)是醫(yī)學(xué)實驗中的一種造模方法，此動物模型可很好的體現(xiàn)兩只動物經(jīng)聯(lián)體手術(shù)后形成血液、體液交互，達到共生目的，觀察聯(lián)體動物之間從血液到免疫等各個層面對機體的影響。聯(lián)體共生動物常以小鼠作為模型動物，在醫(yī)學(xué)實驗研究中應(yīng)用超過了150年，其中以美國、英國、瑞士及日本應(yīng)用聯(lián)體共生動物模型的研究較多，我國對這一實驗方法應(yīng)用較少。2013年，F(xiàn)rancesco S.L等應(yīng)用聯(lián)體共生小鼠模型在cell雜志上發(fā)表了一篇循環(huán)因子

2、GDF11(Growth Differentiation Factor-11，GDF11)逆轉(zhuǎn)年齡相關(guān)性心肌肥厚的文章，引起轟動，隨后science雜志在2014年相繼發(fā)表兩篇文章佐證這一觀點，證實GDF11有改善衰老小鼠的大腦和骨骼肌的功能，使這一實驗造模方法再次引發(fā)關(guān)注。
　　腫瘤是由逃避了機體的免疫監(jiān)視而生長繁殖的惡性細胞組成。R.DSchreiber提出的腫瘤免疫編輯理論認為，免疫系統(tǒng)不但具有排除腫瘤細胞的能力，也有促進腫

3、瘤生長的作用。癌細胞在機體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展是一個免疫系統(tǒng)與癌細胞相互作用的動態(tài)過程。那么，聯(lián)體共生模型對腫瘤的生長是起到促進作用還是抑制作用。聯(lián)體共生模型能否為腫瘤的治療提供新的免疫治療方向，兩只共生小鼠中若其中一只為患腫瘤小鼠，另一只為健康小鼠，兩者血液交互后，健康小鼠的細胞及體液因素能否影響到患腫瘤的小鼠，給予其免疫學(xué)支持，進而起到共同打擊癌細胞的作用，若存在這一作用，那么是健康小鼠自身的細胞及體液因素對患腫瘤小鼠的影響還是患病小鼠自身

4、的細胞及體液因素受到來自健康小鼠的激活后，產(chǎn)生接種疫苗的效果，自身分泌大量抗腫瘤因子從而抵抗或打擊腫瘤細胞。而且，兩只共生小鼠是如何做到移植耐受，嵌合體與耐受狀態(tài)的關(guān)系。
　　因此，本實驗深入探討異基因聯(lián)體共生模型在腫瘤學(xué)方面的應(yīng)用，尋找對腫瘤細胞具有殺傷及抑制作用的細胞及體液因素。本實驗從以下幾個方面進行了研究:1、建立異基因聯(lián)體共生模型，觀察異基因聯(lián)體共生模型小鼠的生理變化情況。2、成功建立聯(lián)體共生模型后，應(yīng)用流式細胞學(xué)技術(shù)檢

5、測聯(lián)體共生小鼠脾臟T細胞的情況，以及兩只小鼠T細胞的相互影響，并對腫瘤的殺傷作用。3、應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，從形態(tài)學(xué)分析聯(lián)體共生小鼠的腫瘤殺傷情況分析。
　　本研究論文分為三個部分:
　　第一部分聯(lián)體共生模型小鼠的建立
　　目的:建立異基因聯(lián)體共生小鼠模型，觀察在聯(lián)體狀態(tài)下荷瘤小鼠瘤體積變化，論證該模型的合理性。
　　方法:選取異基因聯(lián)體共生小鼠，在兩只小鼠肘關(guān)節(jié)遠端4～5 mm處，沿著肱骨和肋骨側(cè)面直到腰圍線末

6、端，連接皮膚和皮下組織，建立聯(lián)體模型。觀察聯(lián)體共生模型的成模率，血液交互時間，荷瘤小鼠瘤體積變化。
　　結(jié)果:成熟階段的手術(shù)成功率率明顯高于模擬階段(P＜0.05)，術(shù)后第三天建立血液交互，成模率為85.7％，且在手術(shù)后d2，d4，d6及d12，瘤體積較陽性對照組小，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:成功建立異基因聯(lián)體共生小鼠模型，小鼠可很好地適應(yīng)聯(lián)體共生狀態(tài)，該模型在醫(yī)學(xué)實驗中可推廣應(yīng)用。
　　第二部分聯(lián)體

7、共生模型對聯(lián)體共生小鼠脾臟T細胞的影響
　　目的:分析聯(lián)體共生模型對B16腫瘤細胞的影響。
　　方法:應(yīng)用流式細胞技術(shù)，分別檢測聯(lián)體共生模型小鼠的脾細胞中CD4+T細胞，CD8+T細胞及IL-2，IL-4，IL-10，IFN-γ的表達。
　　結(jié)果:血液交互產(chǎn)生后，GFP+ C57小鼠的健康細胞經(jīng)過連通的毛細血管網(wǎng)進入荷瘤小鼠血液循環(huán)內(nèi)，刺激荷瘤小鼠CD4+，CD8+增加，其中荷瘤小鼠CD4+的增加比陽性對照組高，具有統(tǒng)

8、計學(xué)意義(P＜0.05)。GFP+在荷瘤小鼠體內(nèi)檢測到的含量較少，但是刺激荷瘤小鼠自身產(chǎn)生CD4+IL-4,CD4+IL-10(P＜0.05)。GFP+小鼠CD4+IL-2,CD4+IL-4,CD4+IL-10均高于陰性對照組(P＜0.05)。聯(lián)體共生模型的兩只小鼠，IFN-γ分泌均下降(P＜0.05)。聯(lián)體GFP+小鼠CD4/CD8較陰性對照組CD4/CD8比值高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:聯(lián)體共生模型對腫瘤小鼠

9、起到了免疫調(diào)節(jié)的作用，為今后腫瘤的免疫治療提供依據(jù)。
　　第三部分聯(lián)體共生模型對腫瘤T細胞的影響
　　目的:分析聯(lián)體共生模型對B16腫瘤細胞的影響。
　　方法:選用聯(lián)體手術(shù)后d8，d14聯(lián)體荷瘤小鼠的腫瘤組織，應(yīng)用免疫組化的方法:觀察CD3，CD4，CD8，CD31，IFN-γ，VEGF的變化情況。
　　結(jié)果:(1) HE染色鏡下觀察腫瘤有不完整的包膜形成，腫瘤細胞呈巢狀堆積，核大，深染，可見較多核分裂像，有多少

10、不等的壞死灶，胞漿和胞核有棕黃色沉淀為陽性。(2)聯(lián)體荷瘤組CD3，CD4，CD8，IFN-γ細胞陽性率較高，OD值分別為（0.32±0.63），（0.33±0.00），（0.31±0.91），（0.28±0.14），與陽性對照組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CD31和VEGF可見細胞陽性率表達較低，分別為（0.19±0.50），（0.19±0.21），與陽性對照組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(3)陽性對照組CD31，VE

11、GF細胞陽性率較高，OD值分別是(0.32±0.35)，(0.29±0.35)，但與聯(lián)體荷瘤組比較，，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。d8時CD3、CD4、CD8和INF-r圖中可見細胞陽性率表達較低，分別為0.22，0.17，0.15，0.16，與聯(lián)體荷瘤組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:聯(lián)體共生模型可刺激聯(lián)體荷瘤小鼠的CD3，CD4，CD8，IFN-γ的產(chǎn)生，起到免疫調(diào)節(jié)，腫瘤殺傷的作用，P＜0.05。聯(lián)體荷瘤組