運動對肝癌切除術后小鼠淋巴細胞增殖及免疫相關通路的影響.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌)在2015年中國惡性腫瘤發(fā)病率中位列第四位，死亡率中位列第三位，是較為兇險的一種癌癥類型。最佳的治療方法依然是早期手術切除。隨著診療技術的進步，患者在早期得以診斷，肝癌患者手術切除率及術后生存率顯著提高，患者對術后生活質量的提高有著迫切的需求，腫瘤康復成為研究熱點。但據相關機構統(tǒng)計，手術切除后5年的復發(fā)率依然高于60％，小肝癌經過完整切除后也有40％以上的復發(fā)

2、率[1]。研究顯示肝癌術后復發(fā)與患者免疫功能有著高度相關性，在圍手術期，手術創(chuàng)傷引起的應激反應可抑制患者免疫功能，使機體的免疫功能無法有效抑制殘余癌細胞的增殖和擴散，導致術后腫瘤轉移的風險增加，與其他部位癌癥相較，患者五年生存率低，生活質量差[2]。因此，如何避免肝癌的復發(fā)和轉移成為治療肝癌的重點，改善肝癌患者術后免疫功能對于提高肝癌患者的長期存活率具有重要意義，成為腫瘤康復的重要議題之一。
　　中醫(yī)藥作為補充替代腫瘤學的主要手段

3、之一，大大豐富了腫瘤康復的內容。早在春秋戰(zhàn)國時期就出現(xiàn)導引術，作為呼吸運動和軀體運動相結合的醫(yī)療體育方法。導引術最早見于《莊子·刻意》，在《金匱要略》中就已出現(xiàn)用導引術治療相關疾病的條目。在馬王堆漢墓中出土的《導引圖》中詳細記載了44幅小型全身導引圖。至隋朝，導引術正式作為醫(yī)療手段記載于巢元方的《諸病源候論》中，并提出肝臟疾病的導引治療方法。
　　現(xiàn)代醫(yī)學建議運動療法作為腫瘤術后康復的主要治療手段之一，適度且有規(guī)律的長期運動對機體

4、的免疫功能有很好的提高作用，具體主要體現(xiàn)在提高免疫細胞及相關免疫因子的活性。且有動物實驗表明，中等強度的長期運動鍛煉對緩解和抑制腫瘤細胞的生長擴散有幫助[3]。
　　但是腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制是十分復雜的，目前關于運動對肝癌術后患者的影響尚缺乏相關資料，尚無一套明確且規(guī)范的運動方案用于肝癌患者術后康復，也缺乏該階段運動與免疫狀態(tài)相關的客觀理論依據。
　　本研究構建了肝原位移植瘤切除術后小鼠模型，并對模型小鼠術后自發(fā)活動度、肝功能

5、、淋巴細胞細胞功能等進行研究，探索模型小鼠在術后一般狀態(tài)及免疫功能的恢復情況。在分析模型小鼠術后狀態(tài)后，在術后不同時間對小鼠進行不同強度的跑臺運動，觀察運動對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響并進一步研究運動對小鼠淋巴細胞增殖能力影響的分子機制，為后續(xù)實驗奠定基礎。
　　一 肝原位移植瘤切除術對小鼠一般狀態(tài)及免疫功能的影響
　　目的:
　　構建肝原位移植瘤切除術后小鼠模型，觀察手術對小鼠一般狀態(tài)和免疫功能的影響。
　　方

6、法:
　　1、構建肝原位移植瘤切除術后小鼠模型，采用自發(fā)活動儀觀察模型小鼠術后不同時間節(jié)點（術后第一天、第三天、第五天、第七天、第九天）自發(fā)活動度水平。
　　2、采集模型小鼠外周血，檢測其血清白蛋白(albumin，ALB)、膽紅素(totalbilirubin，TB)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartatetransaminase，AST)、乳酸脫氫酶(lac

7、tate dehydrogenase，LDH)分泌水平。
　　3、制備模型小鼠脾淋巴細胞懸液，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(erzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)法檢測其IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ等細胞因子分泌水平。
　　4、MTT比色法檢測各組模型小鼠脾淋巴細胞增殖能力。
　　5、流式細胞術檢測模型小鼠脾淋巴細胞表面CD4+/CD8+比例。

8、　　結果:
　　1、本研究結果表明，模型小鼠術后第一、三、五天的自發(fā)活動總路程分別為(782.54±142.95)cm、(932.22±46.90)cm、(1040.57±208.83)cm，與正常組小鼠(1291.06±79.96)cm相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。第七天模型小鼠自發(fā)活動總路程(1212.07±85.50)cm和第九天模型小鼠自發(fā)活動總路程(1144.11±59.79)cm與正常小鼠比較，差異無統(tǒng)計學

9、意義。
　　2、通過檢測小鼠血清發(fā)現(xiàn)，模型小鼠術后第一天肝功能損傷最為嚴重，除ALB外，TB為(2.4±0.16)umol/L、ALT為(364.00±46.5)u/L、AST為(1453.60±295.29)u/L、LDH為(2853.60±249.73)u/L均遠高于正常小鼠，差異具有統(tǒng)計學意義。其中，ALT、AST、LDH趨勢一致，均在術后快速升高，第一天即達到峰值，之后逐步下降。TB的升高遲于轉氨酶的變化，結果顯示，TB在

10、術后第一天上升(2.4±0.16)umol/L，第三天達到峰值(2.42±0.23) umol/L，后逐步下降。ALB各組之間差異無統(tǒng)計學意義。
　　3、術后第一天和第三天小鼠淋巴細胞轉化率分別為(85.27±0.04)％和(97.54±0.16)％，均小于正常小鼠(172.38±0.21)％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但小鼠的免疫功能在逐步恢復，術后第七天淋巴細胞增殖能力為(128.51±0.27)％，較第一天小鼠的免疫

11、功能有所提高。
　　4、術后小鼠各個炎癥細胞因子分泌水平遠高于正常小鼠，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。除TGF-β外，各個細胞因子均在術后快速升高，第一天即達到峰值，之后逐步下降。說明手術破壞了Th1/Th2類細胞因子平衡，導致Th極化漂移，產生免疫紊亂。
　　5、在本實驗中，術后第一天組小鼠淋巴細胞CD4+/CD8+比值為(1.61±0.33)，術后第三天組小鼠淋巴細胞CD4+/CD8+比值為(3.21±0.45)，

12、術后第五天組小鼠淋巴細胞CD4+/CD8+比值為(3.40±0.34)，三組與正常小鼠相較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05），正常組小鼠淋巴細胞CD4+/CD8+比值為(5.46±1.07)。且術后第七天組小鼠也高于術后前五天組小鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　結論:
　　較正常小鼠，肝原位移植瘤手術對小鼠自發(fā)活動水平和肝功能造成損傷，抑制機體淋巴細胞增殖，使CD4+/CD8+比值失調，說明肝原位瘤切除術對小

13、鼠造成了應激損傷，產生了免疫抑制。
　　二 運動對肝原位移植瘤切除術后小鼠淋巴細胞增殖及部分免疫相關通路的影響
　　目的:
　　觀察不同運動時機和運動強度對原位移植瘤切除術后小鼠淋巴細胞增殖能力的影響及其機制。
　　方法:
　　1、制備肝原位瘤術后小鼠模型，對小鼠在不同運動介入時間進行不同運動強度的干預。
　　2、制備模型小鼠脾淋巴細胞懸液，采用MTT比色法檢測運動對模型小鼠淋巴細胞增殖能力的影響。<

14、br>　　3、采用PathScan(R)抗體芯片技術進行初篩，蛋白質印跡法(Western Blot，WB)進行驗證，探尋運動對肝原位移植瘤切除術后小鼠免疫功能影響的分子機制。
　　結果:
　　1、在術后早期進行中等強度運動干預對小鼠淋巴細胞增殖能力影響不大，為(258.24±0.64)％，與正常小鼠淋巴細胞增殖能力(297.91±0.28)％之間差異無統(tǒng)計學意義，但高強度運動干預在一定程度上抑制了模型小鼠淋巴細胞增殖能力，

15、為(142.03±0.24)％，低于正常小鼠，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　2、在術后后期進行中等強度運動干預的小鼠淋巴細胞增殖能力為(221.76±0.24)％，與正常小鼠淋巴細胞增殖能力(194.16±0.71)％之間的差異無統(tǒng)計學意義，但高強度運動在一定程度上增強了模型小鼠淋巴細胞增殖能力，為(359.87±0.78)％，高于正常小鼠，且差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　3、經過PathScan(

16、R)抗體芯片技術初篩后發(fā)現(xiàn)，運動對肝原位移植瘤切除術后小鼠淋巴細胞的影響主要是通過IL6/JAK2/STAT3和PI3k/AKT/mTOR/STAT3兩條通路。經過WB驗證后發(fā)現(xiàn)術后后期運動可以提高磷酸化STAT3、磷酸化AKT等關鍵蛋白的表達，對淋巴細胞增殖起正向調節(jié)作用。
　　結論:
　　術后早期進行高強度運動對小鼠淋巴細胞增殖能力存在負向調節(jié)作用，術后后期進行高強度運動對小鼠淋巴細胞增殖能力有促進作用。運動可能通過IL