Tmubl基因沉默對大鼠肝部分切除術后肝細胞增殖周期的影響.pdf

1、肝部分切除術(Partial Hepatectomy，PH)是目前治療各種肝臟良惡性疾病最有效方法之一。但擴大性肝切除術后易出現(xiàn)致命性肝功能衰竭，其治療仍是世界性難題。雖然肝移植是有效治療途徑，但供體嚴重不足限制其廣泛開展；現(xiàn)有生物人工肝技術仍不能完全替代肝臟功能；肝細胞移植體內后增殖有限，也限制其治療效果。肝臟與其它器官不同，具有巨大的潛在再生能力，肝切除術后殘肝主要通過成熟的肝細胞復制增殖實現(xiàn)再生。但目前對其自身調控機制研究極少，僅

2、有少量文獻報告TGF-β表現(xiàn)為負向調控肝細胞增殖。因此，探索肝細胞再生分子機制具有極其重要的現(xiàn)實意義，從而為臨床促進肝再生、防治肝功能衰竭奠定理論基礎。
　　 我們前期國家自然科學基金課題研究顯示，Tmubl蛋白在肝細胞增殖周期中對其增殖進程發(fā)揮了重要的自身調控作用。Tmubl于2005年首次報道，包含245個氨基酸，其結構主要有1個類似泛素結構的區(qū)域(UBL；121-175aa)，包含了與UCH、E2和CUE的反應位點。目前對

3、Tmubl基因及其蛋白研究結果：Tmubl蛋白為一種穿梭蛋白。過表達Tmubl可顯著抑制大鼠H-35肝癌細胞增殖；Tmubl沉默后導致異常中心體、多核細胞出現(xiàn)以及異常紡錘體形成。這些研究結果均表明Tmubl基因及其蛋白產(chǎn)物在肝再生細胞增殖周期中發(fā)揮了重要的調控作用，但其具體的機制還不十分明確。
　　 目前體外肝細胞基因轉染已有許多報道，技術趨于成熟，而體內肝臟基因轉染方法不一，有通過小鼠尾靜脈注射的，但常需注射大量的病毒質粒，超

4、過小鼠生理負荷量，甚至致死，而且轉染效率低：較普遍通過大鼠門靜脈注射法，可以減少病毒注射量，轉染效率明顯好于尾靜脈注射，但門靜脈位置深，易出血致實驗失敗，而且通過門靜脈注射引起入肝血流量的變化，肝竇壓力改變，可導致肝竇狀細胞分泌多種細胞因子，改變了肝臟原有內環(huán)境，導致潛在實驗性干擾。如何優(yōu)化體內肝臟基因轉染途徑以進一步完善肝臟的研究方法及其臨床運用，這些問題還未見報道。
　　 目的：
　　 1、探討肝臟基因轉染大鼠體內動

5、物實驗模型，通過對比探討一種既操作方便、對大鼠刺激反應較小，又具有較高基因轉染率的大鼠肝內基因轉染方法。
　　 2、通過沉默Tmubl基因，觀察大鼠肝切除術后肝細胞增殖周期進程的變化及Tmubl蛋白對肝再生的影響。
　　 3、初步探討Tmubl蛋白對肝細胞增殖周期調控機制，分析可能相關的調控蛋白及作用機制。
　　 研究內容及方法：
　　 1.大鼠肝臟Tmubl RNAi慢病毒體內轉染及效果檢測的實驗研究<

6、br>　　 1.1大鼠動物實驗及分組。大鼠的盲腸靜脈粗大，位置表淺，易于尋找，操作簡單，周圍有豐富的脂肪組織，并且盲腸靜脈屬于門靜脈的屬支，因此，將大鼠分為盲腸靜脈組、門靜脈組、尾靜脈組及對照組，分別注射攜帶綠色熒光蛋白(GFP)重組Tmubl RNAi慢病毒。
　　 1.2在肝內基因轉染后第二天行肝臟組織冰凍切片，運用激光共聚焦顯微鏡觀察各組GFP表達情況，比較各組轉染率。
　　 1.3評估經(jīng)門靜脈和盲腸靜脈注射對門

7、靜脈壓力的影響。設盲腸靜脈和門靜脈注射組各3只大鼠，用PowerLab/8sp數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(ADinstruments，AU)檢測在注射時門靜脈壓力的變化情況，以此比較兩者注射方式對門靜脈壓力的影響。
　　 1.4檢測三種注射方法對大鼠肝功及機體刺激反應的影響。在注射后第二天同時取5 ml非抗凝門靜脈血，ELISA試劑盒(eBioscience，San Diego，CA)檢測每份標本的谷丙轉氨酶(alanine aminotra

8、nsferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、腫瘤壞死因子-a(Tumor Necrosis Factor-a，TNF-a)和白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)的值，每份標本至少檢測3次，進行統(tǒng)計分析。
　　 2、研究Tmubl沉默對肝切除術后肝再生細胞增殖周期影響
　　 2.1大鼠動物實驗及分組。在體內肝臟成功轉染后，復制經(jīng)典的70%大鼠肝切除術動物

9、模型，于PH術后第2天提取原代肝細胞及肝組織作為標本，研究Tmubl沉默對肝切除術后肝再生細胞增殖周期影響。將36只大鼠隨機分三組，即Tmubl RNAi實驗組，慢病毒空載體組，對照組，每組均分別取PH術后0h、2h、12h、24h共4個時相點各3只大鼠。
　　 2.2運用RT-PCR法及Western Blot法分別檢測提取的肝細胞樣本中的Tmubl基因及securin基因的mRNA水平和蛋白表達情況，其中對Tmubl的檢測反

10、映RNAi慢病毒干擾效果及Tmubl沉默效果，對securin的檢測反映Tmubl沉默后對其基因水平及蛋白水平的影響。
　　 2.3用噻唑藍(MTT)實驗檢測各組肝細胞增殖情況。將各組肝部分切除術后提取的細胞收集到含血清的培養(yǎng)基中，將細胞稀釋至25×103個/ml，加入MTT試劑溫育3h，用酶標儀檢測OD值，繪制曲線圖。
　　 2.4流式細胞儀觀察各實驗組細胞周期情況。將各實驗組提取細胞的細胞固定，半個小時左右行流式細胞

11、儀檢測，及時分析數(shù)據(jù)結果。
　　 2.5 Immunoprecipitation法及蛋白質譜分析檢測Tmubl蛋白與securin相互作用。在收獲的細胞中加入適量細胞IP裂解緩沖液提取蛋白，將10-50μl securin抗體加入到細胞裂解液進行免疫沉淀，并行Western blotting電泳分析及蛋白質譜分析。
　　 結果：
　　 1.大鼠肝臟Tmubl RNAi慢病毒體內轉染及效果檢測的實驗研究
　　

12、 1.1大鼠體內肝臟慢病毒注射操作情況。統(tǒng)計三組平均注射操作時間，經(jīng)門靜脈注射最復雜、耗時，尾靜脈注射最方便，而經(jīng)盲腸靜脈平均注射時間約8-17分鐘。三組實驗操作成功率方面，經(jīng)盲腸靜脈及尾靜脈注射全部成功，而經(jīng)門靜脈注射組有3只大鼠死亡，其死亡原因均為腹腔內出血，盲腸靜脈周圍有豐富的脂肪組織，注射后壓迫10秒后即可止血。
　　 1.2激光共聚焦顯微鏡觀察肝臟冰凍切片的GFP表達情況，盲腸靜脈組與門靜脈組均可明顯觀察到較強綠色熒

13、光，兩組轉染效果基本一致，并且綠色熒光表達在肝細胞索上，尾靜脈注射組僅觀察到散在熒光，轉染率較低，在對照組的大鼠肝臟切片中均未見綠色熒光。
　　 1.3測壓實驗中，門靜脈注射明顯增加門靜脈壓力，而經(jīng)盲腸靜脈注射對門靜脈的影響較小，在注射操作時僅引起瞬間波動，但很快就能恢復至正常水平。
　　 1.4血清肝轉氨酶、IL-6和TNF-a的ELISA結果。盲腸靜脈組血清轉氨酶(ALT182.0±29.9 IU/L，AST114.

14、4±17.5 IU/L)及IL-6和TNF-a值(IL-6244.5±48.4 pg/ml，TNF-a137.4±81.8 pg/ml)明顯低于門靜脈組和尾靜脈組，差異具有統(tǒng)計學意義(n=20，P<0.001)，盲腸靜脈注射方式明顯減輕對肝功及機體的應急刺激反應的影響。
　　 2.研究Tmubl沉默對肝切除術后肝再生細胞增殖周期影響
　　 2.1.Tmubl RNAi干擾效果檢測，實驗組Tmubl mRNA和蛋白表達均被

15、有效抑制(p<0.05)，結果與激光共聚焦結果基本一致。
　　 2.2 MTT實驗顯示，Tmubl RNAi實驗組明顯上調PH術后6h-24h肝細胞的增殖速率。同時流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，Tmubl沉默組肝細胞增殖的G2/M期占11.07%，高于對照組2.68%，兩組細胞比例數(shù)具有明顯差別。Tmubl沉默后，PH術后肝細胞增殖加速，主要集中在G2/M期細胞。說明Tmubl蛋白下調了G2/M期肝細胞的增殖速率。
　　 2.3

16、RT-PCR及Western Blot結果發(fā)現(xiàn)，Tmubl沉默后，對securin mRNA無影響，但實驗組G2/M期細胞中securin蛋白表達明顯下調。這說明Tmubl對securin在基因轉錄水平無明顯影響，而主要作用于蛋白水平，進一步證明了Tmubl蛋白與securin降解間存在某種關系。
　　 2.4 IP實驗結果提示Tmubl蛋白和securin能在肝細胞中發(fā)生結合，同時，進一步進行蛋白質譜分析明確Tmubl蛋白和s

17、ecurin能在肝細胞中發(fā)生結合，并且兩蛋白間產(chǎn)生了相互作用。
　　 結論：
　　 1、通過大鼠的盲腸靜脈注射行肝內基因轉染，這種方式對實驗動物的應激刺激小，操作相對簡單，并且可獲得較好的轉染效果，是一種便捷、安全的肝內基因轉染途徑。
　　 2、重組慢病毒載體可攜帶目前基因干擾片片段和GFP探針用于動物體內實驗，并且能較好發(fā)揮較好的基因干擾效果。
　　 3、Tmubl沉默后導致肝細胞G2/M期增殖速率明顯