RNA干擾下調(diào)CDK9表達(dá)對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞增殖作用的研究.pdf

1、【目的】 CDK9(Cyclin-Dependent Kinase9，細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶9)是正性轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子b(Positive Transcription Elongation Factor b，P-TEFb)的催化亞基，通過(guò)磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ)和一些負(fù)性轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子(Negative Elongation Factor)從而使轉(zhuǎn)錄從起始部位得以延伸。CDK9被認(rèn)為無(wú)論在生理情況下

2、還是在疾病發(fā)生中，從腫瘤的形成到HIV-1編碼的Tat蛋白反轉(zhuǎn)錄激活中均具有重要作用。本研究通過(guò)靶向性小干擾RNA(siRNA)，特異性沉默CDK9基因的表達(dá)，研究其對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞增殖的作用，從而進(jìn)一步為艾滋病和腫瘤的發(fā)病機(jī)制和治療提供基礎(chǔ)研究。 【方法】 利用體外轉(zhuǎn)錄合成的方法合成針對(duì)CDK9分子的小干擾RNA，脂質(zhì)體法將不同濃度梯度siRNA轉(zhuǎn)染人外周血T淋巴細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞分別采取RT-PC

3、R和Western Blot觀察干擾后CDK9的mRNA和蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾后T細(xì)胞凋亡率變化和細(xì)胞周期變化，從而探討CDK9分子在人外周血T淋巴細(xì)胞增殖中的作用。 【結(jié)果】 (1)靶向CDK9基因的siRNA可以有效的抑制CDK9基因的表達(dá)，其中SⅠ siRNA干擾效果最強(qiáng)，選為最佳siRNA，RT-PCR顯示mRNA表達(dá)水平相比對(duì)照組下調(diào)達(dá)90％以上；Western Blot顯示兩條CDK9條帶：分子量

4、分別為42kD和55kD：55kD的蛋白表達(dá)減少可達(dá)90％以上，42kD的蛋白表達(dá)減少50％； (2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞凋亡率轉(zhuǎn)染組為23.98％±0.030％，與陰性對(duì)照組14.76％±0.067％和空白對(duì)照組16.72％±0.043％比較有顯著提高，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；而陰性和空白對(duì)照組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干擾CDK9表達(dá)后細(xì)胞周期相比陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組無(wú)明顯變化。 【