丹參多糖和丹參素鈉促進人外周血T淋巴細胞增殖藥理作用及機制研究.pdf

1、目的：研究丹參多糖(Salvia miltiorrhiza polysaccharide,SMP)和丹參素鈉(sodium Danshensu,SDSS)對人外周血T淋巴細胞增殖和殺傷活性的影響及其作用機制。
　　方法：采用水提醇沉法提取SMP并純度鑒定；Ficoll密度梯度離心法分離人外周血淋巴細胞，細胞分為兩部分，一部分淋巴細胞加藥處理，流式細胞儀檢測不同濃度SMP和SDSS對淋巴細胞表型(CD3+、CD14+、CD19+、C

2、D56+)的影響；倒置熒光顯微鏡、細胞計數(shù)儀和CFSE染色考察不同濃度SMP和SDSS對淋巴細胞增殖的影響；鈣黃綠素法檢測其對淋巴細胞殺傷能力的影響；一部分細胞按照CIK培養(yǎng)，加入細胞因子刺激活化，按照上述步驟檢測兩種藥物對CIK細胞增殖的影響。
　　提取細胞樣品總RNA和蛋白，用RT-PCR檢測細胞增殖相關(guān)基因IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TLR家族mRNA基因表達變化。用Western Blotting檢測MAPK

3、信號通路和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白ERK、JNK、IκBα、p-p65等蛋白的變化。為驗證SMP和SDSS刺激T淋巴細胞增殖活化是否是通過MAPK信號通路和NF-κB信號通路發(fā)揮作用，分別用ERK抑制劑(U0126)、JNK抑制劑(SP600125)和IκBα抑制劑(BAY11-7082)和藥物處理細胞，Western Blotting檢測p-JNK，p-ERK，p-p65，IκBα，IKKα和IKKβ蛋白表達變化，用細胞計數(shù)儀檢測加

4、入抑制劑后T淋巴細胞的數(shù)目變化。
　　結(jié)果：SMP(25、50、100μg/mL)和SDSS(6.25、12.5、25μM)可劑量依賴性的促進PBMC和CIK細胞增殖，顯著提高T淋巴細胞的殺傷能力；不同程度增強IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γmRNA和TLR1、TLR2、TLR4 mRNA基因表達；Western blotting結(jié)果證實SMP(25、50、100μg/mL)和SDSS(6.25、12.5、25μM)處理外

5、周血淋巴細胞24h后，使p-ERK、p-JNK、IKKα、IKKβ表達上調(diào)，且p-ERK、p-JNK和IKKβ蛋白表達呈劑量依賴性，IκBα蛋白表達下調(diào)，細胞質(zhì)內(nèi)p-p65蛋白表達呈劑量依賴性下調(diào)，細胞核內(nèi)p-p65蛋白表達呈劑量依賴性上調(diào)。U0126、SP600125和BAY11-7082抑制劑阻斷信號通路后，SMP和SDSS藥物處理組MAPK和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達量顯著降低，淋巴細胞數(shù)目減少。
　　結(jié)論：SMP和SD