shRNA介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞CD28基因的沉默效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【目的】構(gòu)建含有小鼠U6啟動(dòng)子和CD28-shRNA插入序列的質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，研究特異性短發(fā)夾狀RNA(short hairpin RNA,shRNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference,RNAi)效應(yīng)，探索一種長(zhǎng)期、穩(wěn)定的阻斷CD28/B7共刺激途徑，抑制T淋巴細(xì)胞活化的手段<'[1,2]>，為進(jìn)一步研究shRNA在防治移植物抗宿主病中的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【方法】 1.根據(jù)小鼠C

2、D28基因已知序列(基因編號(hào)：NM-007642)設(shè)計(jì)3條特異性 CD28-shRNA(CD28-shRNA-1、CD28-shRNA-2、CD28-shRNA-3)插入序 列和1條非特異性shRNA插入序列。 2.應(yīng)用分子克隆技術(shù)將CD28-shRNA的3條特異性和1條非特異性插入序列與pSilencer 1.O-U6載體連接，通過酶切電泳以及序列測(cè)定后鑒定，并中量制備。 3.采用Inoue法、CaCI<,2>法和

3、RbCL法制備DH5 α菌種來源的感受態(tài)細(xì)胞，比較三種感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，篩選出高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。 4.獲取小鼠脾淋巴細(xì)胞并培養(yǎng)，采用siPORTXP-1轉(zhuǎn)染試劑，分別在第2～21天將構(gòu)建好的CD28-shRNA質(zhì)粒載體以及非特異性shRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24小時(shí)后的小鼠淋巴細(xì)胞，獲得干擾1～20天細(xì)胞樣本。 5.分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和Western blots技術(shù)檢測(cè)各組干擾1～20天的細(xì)胞樣本的mR

4、NA水平和蛋白質(zhì)水平的變化。 【結(jié)果】 1．根據(jù)小鼠CD28基因已知序列和設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，得到了預(yù)期的DNA條帶(431bp)；對(duì)CD28蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)合蛋白質(zhì)Maker得出45KD的蛋白質(zhì)條帶，從而從mRNA及蛋白質(zhì)水平鑒定出CD28基因的表達(dá)。 2．經(jīng)對(duì)Inoue法、CaCL<’2>法和RbCL法制備的三種感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率的比較，得出Inoue法感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率最高。

5、 3．成功構(gòu)建了3條特異性CD28-shRNA和1條非特異性的shRNA質(zhì)粒載體，經(jīng)酶切、電泳分析以及質(zhì)粒載體的序列測(cè)定證實(shí)。 4．實(shí)驗(yàn)組shRNA(shRNA-CD28-1、2、3)介導(dǎo)的RNAi在mRNA水平可以實(shí) 現(xiàn)對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞CD28基因的長(zhǎng)期、穩(wěn)定的干擾效應(yīng)：shRNA-CD28-1、 2、3組shRNA分別在第5、5、7天達(dá)到最大的相對(duì)抑制率(干擾效率)，分別是1.030、1.039和1.033，在20天后的

6、相對(duì)抑制率仍然可以分別達(dá)到0.756、0.759和0.758。 5．在蛋白質(zhì)水平，shRNA-CD28-1、2、3干擾20天后的相對(duì)抑制率仍然可以分別達(dá)到0.677、0.782和0.777，CD28蛋白的表達(dá)水平的絕對(duì)數(shù)也分別減 低(84.90±0.65)％、(96.49±0.03)％和(91.76±0.32)％，以shRNA-2組干擾效率最高(P＜0.01)，非特異性組未顯示出對(duì)CD28基因的干擾效應(yīng)。 【結(jié)論】