單鏈抗體介導的小干擾RNA選擇性沉默小鼠調(diào)節(jié)性T細胞Foxp3基因表達及效應.pdf

1、Treg(regulatory T cells,Treg)是一群獨特的、具有免疫調(diào)節(jié)功能的、在調(diào)控免疫應答、促進和維持自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用的T細胞。目前,越來越多的證據(jù)表明,Treg在腫瘤免疫逃避中也扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn),包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤及肝癌等各種腫瘤病人的外周血或腫瘤組織中Treg的數(shù)量增加;卵巢癌中存在的高比例Treg與腫瘤病人不良預后密切相關。目前在各種實驗性腫瘤模型中獲得的證據(jù)表明,Tr

2、eg在腫瘤免疫逃避中發(fā)揮顯著的作用,在這些腫瘤模型中直接清除Treg或抑制其功能有效增強了治療性腫瘤疫苗的效果。 腫瘤細胞能夠利用一套精細的直接或間接的主動機制逃避免疫系統(tǒng)的攻擊,這些機制包括：抗原遞呈途徑的丟失或改變、死亡受體信號通路的變化以及產(chǎn)生大量具有免疫抑制功能的細胞因子在腫瘤周圍形成免疫抑制性微環(huán)境。重要的是,腫瘤細胞還能直接招募Treg至腫瘤局部或誘導不成熟的髓性DC分泌TGF-β和IL-10,在上述細胞因子的作用下

3、使CD4+CD25-初始T細胞轉(zhuǎn)化成Treg?；赥reg在腫瘤免疫逃避中的重要性,靶向Treg以提高抗腫瘤免疫應答已獲得大家的共識。目前,各種靶向Treg的策略已在臨床和臨床前模型中進行驗證,按其作用機制,歸納起來主要有以下兩種：一、利用抗CD25抗體或IL-2免疫毒素直接清除Treg；二、通過靶向Treg表面抑制性受體抑制Treg的免疫調(diào)節(jié)功能或降低效應性T細胞對Treg的易感性。然后,通過白介素2受體(IL-2R,即CD25)清除

4、Treg所帶來的益處因為同時清除了激活的效應淋巴細胞以及潛在的誘導新的Treg的產(chǎn)生而喪失。理論上,功能性失活Treg不僅可以去除其免疫抑制活性,同時因維持其生理上的存在而避免源自外周淋巴細胞池的Treg再生成,這樣將有效的增強效應淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫應答。 Foxp3是Treg發(fā)育、功能及維持外周生存最主要的調(diào)控因子。Foxp3基因突變(Sourfy小鼠)或敲除的小鼠,其體內(nèi)Treg功能受損,早期就發(fā)展全身多器官自身免疫性

5、疾病。同樣在人類中,與小鼠Foxp3同源的FOXP3基因突變可引起人患IPEX綜合征、I型糖尿病、克隆氏病等自身免疫性疾病,與Scurfy小鼠和Foxp3基因敲除小鼠的表型相似。Treg穩(wěn)定特異地表達Foxp3轉(zhuǎn)錄因子,因此,在人和嚙齒類動物中,Foxp3聯(lián)合CD4和CD25分子能夠用來鑒定Treg。 Treg的功能需要Foxp3的持續(xù)表達,理論上,沉默F(xiàn)oxp3的表達能夠逆轉(zhuǎn)Treg的免疫抑制活性。然后,Foxp3主要在核內(nèi)表達,因而

6、傳統(tǒng)的靶向策略鞭長莫及,而最近蓬勃發(fā)展的RNA干擾(RNA interfering,RNAi)技術為實現(xiàn)這一設想提供了實際可行的線路[29]。RNAi的某些特性非常適合用于體內(nèi)干擾Treg活性：首先,小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默基因表達是暫時性的,允許靈活的掌握抑制時間的長短；其次,沉默F(xiàn)oxp3表達僅僅只抑制了Treg的活性,而并不干擾效應T細胞的功能；這兩點對于臨床應用很有價值。然后,目

7、前應用siRNA面臨的主要難點是體內(nèi)把siRNA遞送至細胞胞質(zhì)內(nèi)進而啟動RNAi通路降解mRNA。雖然使用轉(zhuǎn)染試劑能夠局部遞送siRNA,但是是非特異的,容易導致嚴重毒性。而通過細胞表面特異性受體介導siRNA遞送將能使siRNA進入特殊細胞,達到最大的治療效果,同時減少藥物用量,避免非特異的基因沉默和細胞毒性。最近Song EW等利用人魚精蛋白的核酸結合活性,構建了抗p24(-種HIV胞膜蛋白)Fab片段和魚精蛋白的融合蛋白,這種蛋白

8、能夠把siRNA特異遞送至HIV感染的淋巴細胞,進而沉默HIV胞膜糖蛋白gp160的表達[30]。 本研究中我們構建了小鼠CD3特異性單鏈抗體一魚精蛋白融合蛋白(2C11scrtp),利用2C11scktp中魚精蛋白段的核酸結合活性以及CD3單鏈抗體的導向功能,遞送Foxp3特異性siRNA至CD3+T細胞中沉默F(xiàn)oxp3基因表達。體內(nèi)外實驗表明,2C11scktp能夠與siRNA結合并把siRNA特異遞送至CD3+小鼠淋巴瘤細

9、胞或小鼠淋巴細胞；2C11scktp遞送的Foxp3特異性siRNA能夠特異沉默Treg中Foxp3蛋白的表達:Foxp3表達下調(diào)的Treg“無能”表型和免疫抑制功能喪失,刺激TCR后分泌Th1型細胞因子,不再能夠抑制初始T細胞的增殖應答；此外,單鏈抗體遞送的siRNA體內(nèi)沒有誘發(fā)干擾素免疫應答。具體實驗內(nèi)容如下： 第一部分：克隆2C11sCκ和2C11sCκtp基因 1.克隆2C11sCκ和2C11sCκtp基因：我們

10、采用一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR直接從產(chǎn)生倉鼠抗小鼠CD3抗體2C11-145的雜交瘤中擴增出VH和VL,測序正確后通過重疊PCR構建2C11sCκ和2C11sCκtp,兩個PCR產(chǎn)物裝入pGEM-Teasy載體擴增。 2.構建2C11sCκ和2C11sCκtp表達載體：我們用HindⅢ和EcoRI雙酶切上述pGEM-Teasy載體獲得2C11sCk和2C11sCktp片段,然后裝入經(jīng)相同酶切的pcDNA3.1(+)中成功構建出含上述兩個

11、基因的表達載體。 第二部分：表達和純化2C11sCk和2C11sCktp蛋白 1.表達2C11sCk和2C11sCktp蛋白：抽提上述構建的表達載體質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染CHO,72h后收獲上清,通過流式檢測與表達小鼠CD3的YAC-1淋巴瘤細胞的結合表明2C11sCk和2C11sCktp蛋白構象正確,結合活性良好,在此基礎上我們進行了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,篩選出了兩株穩(wěn)定高表達2C11sCk：和2C11sCktp蛋白的CHO細胞克隆。

12、 2.純化2C11sCk和2C11sCktp蛋白：大量擴增CHO細胞克隆,收集細胞上清,采用Ni++離子金屬鰲合層析純化目的蛋白。SDS-PAGE和WB實驗顯示純化的蛋白為單一條帶,純度90％以上,分子量與預期相符。純化的2C11sCk和2C11sCktp蛋白體外顯示良好的小鼠CD3結合活性。 第三部分：鑒定小鼠Foxp3基因特異高效的siRNA 1.構建穩(wěn)定高表達鼠Foxp3的細胞系：因為轉(zhuǎn)染小鼠T細胞很困難,因此

13、我們需要構建表達鼠Foxp3的易于轉(zhuǎn)染的細胞系。我們利用表達鼠Foxp3的MIGR1-MFoxp3逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HELA細胞成功構建了高表達鼠Foxp3的細胞系(HELA-MF),半定量、實時定量PCR和WB證實其高表達鼠Foxp3。 2.篩選鼠Foxp3特異高效的siRNA：利用HELA-MF細胞,我們針對QIAGEN公司合成的3個鼠Foxp3特異的siRNA進行了篩選,發(fā)現(xiàn)siRNA A沉默效果最佳,因此,后續(xù)研究中我們主要

14、使用siRNAA驗證單鏈抗體介導的siRNA遞送抑制Foxp3的效果。 第四部分：2C11sCktp蛋白遞送siRNA 1.2C11sCktp蛋白把FAM熒光表達的siRNA特異遞送至CD3+細胞：這部分結果顯示2C11sCktp蛋白能夠與CD3分子和FAM-siRNA結合,把后者特異遞送至CD3+YAC-1、EL-4鼠T淋巴瘤細胞和新鮮分離的小鼠T細胞中,而不是表達人CD3的Jurkat T細胞中。此外,注射2C11s

15、Cktp蛋白與FAM-siRNA形成的復合物至小鼠體內(nèi),6h后流式檢測小鼠脾細胞不同亞群的熒光攝取,發(fā)現(xiàn)只有CD3+T細胞檢測到FAM熒光的存在,而CD14+單核細胞、CO19+B細胞及CD11c+DC胞內(nèi)無FAM-siRNA存在。 2.2C11sCktp蛋白遞送的Foxp3特異的siRNA沉默了自然Treg和TGF-β誘導的Treg中Foxp3的表達：研究表面,Foxp3特異的siRNA能有效被2C11sCktp蛋白而不是對照

16、2C11sCk蛋白遞送至上述兩種Treg中,實時定量PCR、WB和胞內(nèi)Foxp3直接染色都證實Foxp3的表達下調(diào)。 第五部分:Foxp3表達沉默后Treg的表型和功能變化 1.Foxp3表達沉默后Treg的表型：結果表明,隨著Foxp3表達下調(diào),Foxp3調(diào)控的相關基因表達也發(fā)生改變,CD25、CTLA4和GITR等表面標記分子表達下降,而IL-2、IL-7Rα和PDE3B等受Foxp3抑制的基因表達上調(diào)。 2

17、.Foxp3表達沉默后Treg的功能：結果顯示,低表達Foxp3的Treg功能發(fā)生改變,體外受CD3和CD28雙抗刺激后發(fā)生強力增殖,并分泌IL-2,IFN-γ和TNF-α等Th1細胞因子。這部分的結果提示沉默F(xiàn)oxp3表達后Treg的表型和功能向Th1逆轉(zhuǎn)。 第六部分：應用siRNA相關的干擾素免疫應答 體內(nèi)外研究都表明利用2C11sCktp蛋白遞送siRNA不會促發(fā)干擾素等非特異炎癥免疫應答。 結論：