單鏈抗體介導(dǎo)的小干擾RNA選擇性沉默小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3基因表達(dá)及效應(yīng).pdf

1、Treg(regulatory T cells,Treg)是一群獨(dú)特的、具有免疫調(diào)節(jié)功能的、在調(diào)控免疫應(yīng)答、促進(jìn)和維持自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用的T細(xì)胞。目前,越來越多的證據(jù)表明,Treg在腫瘤免疫逃避中也扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn),包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤及肝癌等各種腫瘤病人的外周血或腫瘤組織中Treg的數(shù)量增加;卵巢癌中存在的高比例Treg與腫瘤病人不良預(yù)后密切相關(guān)。目前在各種實(shí)驗(yàn)性腫瘤模型中獲得的證據(jù)表明,Tr

2、eg在腫瘤免疫逃避中發(fā)揮顯著的作用,在這些腫瘤模型中直接清除Treg或抑制其功能有效增強(qiáng)了治療性腫瘤疫苗的效果。 腫瘤細(xì)胞能夠利用一套精細(xì)的直接或間接的主動機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的攻擊,這些機(jī)制包括：抗原遞呈途徑的丟失或改變、死亡受體信號通路的變化以及產(chǎn)生大量具有免疫抑制功能的細(xì)胞因子在腫瘤周圍形成免疫抑制性微環(huán)境。重要的是,腫瘤細(xì)胞還能直接招募Treg至腫瘤局部或誘導(dǎo)不成熟的髓性DC分泌TGF-β和IL-10,在上述細(xì)胞因子的作用下

3、使CD4+CD25-初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成Treg。基于Treg在腫瘤免疫逃避中的重要性,靶向Treg以提高抗腫瘤免疫應(yīng)答已獲得大家的共識。目前,各種靶向Treg的策略已在臨床和臨床前模型中進(jìn)行驗(yàn)證,按其作用機(jī)制,歸納起來主要有以下兩種：一、利用抗CD25抗體或IL-2免疫毒素直接清除Treg；二、通過靶向Treg表面抑制性受體抑制Treg的免疫調(diào)節(jié)功能或降低效應(yīng)性T細(xì)胞對Treg的易感性。然后,通過白介素2受體(IL-2R,即CD25)清除

4、Treg所帶來的益處因?yàn)橥瑫r(shí)清除了激活的效應(yīng)淋巴細(xì)胞以及潛在的誘導(dǎo)新的Treg的產(chǎn)生而喪失。理論上,功能性失活Treg不僅可以去除其免疫抑制活性,同時(shí)因維持其生理上的存在而避免源自外周淋巴細(xì)胞池的Treg再生成,這樣將有效的增強(qiáng)效應(yīng)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。 Foxp3是Treg發(fā)育、功能及維持外周生存最主要的調(diào)控因子。Foxp3基因突變(Sourfy小鼠)或敲除的小鼠,其體內(nèi)Treg功能受損,早期就發(fā)展全身多器官自身免疫性

5、疾病。同樣在人類中,與小鼠Foxp3同源的FOXP3基因突變可引起人患IPEX綜合征、I型糖尿病、克隆氏病等自身免疫性疾病,與Scurfy小鼠和Foxp3基因敲除小鼠的表型相似。Treg穩(wěn)定特異地表達(dá)Foxp3轉(zhuǎn)錄因子,因此,在人和嚙齒類動物中,Foxp3聯(lián)合CD4和CD25分子能夠用來鑒定Treg。 Treg的功能需要Foxp3的持續(xù)表達(dá),理論上,沉默F(xiàn)oxp3的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)Treg的免疫抑制活性。然后,Foxp3主要在核內(nèi)表達(dá),因而

6、傳統(tǒng)的靶向策略鞭長莫及,而最近蓬勃發(fā)展的RNA干擾(RNA interfering,RNAi)技術(shù)為實(shí)現(xiàn)這一設(shè)想提供了實(shí)際可行的線路[29]。RNAi的某些特性非常適合用于體內(nèi)干擾Treg活性：首先,小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默基因表達(dá)是暫時(shí)性的,允許靈活的掌握抑制時(shí)間的長短；其次,沉默F(xiàn)oxp3表達(dá)僅僅只抑制了Treg的活性,而并不干擾效應(yīng)T細(xì)胞的功能；這兩點(diǎn)對于臨床應(yīng)用很有價(jià)值。然后,目

7、前應(yīng)用siRNA面臨的主要難點(diǎn)是體內(nèi)把siRNA遞送至細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)而啟動RNAi通路降解mRNA。雖然使用轉(zhuǎn)染試劑能夠局部遞送siRNA,但是是非特異的,容易導(dǎo)致嚴(yán)重毒性。而通過細(xì)胞表面特異性受體介導(dǎo)siRNA遞送將能使siRNA進(jìn)入特殊細(xì)胞,達(dá)到最大的治療效果,同時(shí)減少藥物用量,避免非特異的基因沉默和細(xì)胞毒性。最近Song EW等利用人魚精蛋白的核酸結(jié)合活性,構(gòu)建了抗p24(-種HIV胞膜蛋白)Fab片段和魚精蛋白的融合蛋白,這種蛋白

8、能夠把siRNA特異遞送至HIV感染的淋巴細(xì)胞,進(jìn)而沉默HIV胞膜糖蛋白gp160的表達(dá)[30]。 本研究中我們構(gòu)建了小鼠CD3特異性單鏈抗體一魚精蛋白融合蛋白(2C11scrtp),利用2C11scktp中魚精蛋白段的核酸結(jié)合活性以及CD3單鏈抗體的導(dǎo)向功能,遞送Foxp3特異性siRNA至CD3+T細(xì)胞中沉默F(xiàn)oxp3基因表達(dá)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,2C11scktp能夠與siRNA結(jié)合并把siRNA特異遞送至CD3+小鼠淋巴瘤細(xì)

9、胞或小鼠淋巴細(xì)胞；2C11scktp遞送的Foxp3特異性siRNA能夠特異沉默Treg中Foxp3蛋白的表達(dá):Foxp3表達(dá)下調(diào)的Treg“無能”表型和免疫抑制功能喪失,刺激TCR后分泌Th1型細(xì)胞因子,不再能夠抑制初始T細(xì)胞的增殖應(yīng)答；此外,單鏈抗體遞送的siRNA體內(nèi)沒有誘發(fā)干擾素免疫應(yīng)答。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下： 第一部分：克隆2C11sCκ和2C11sCκtp基因 1.克隆2C11sCκ和2C11sCκtp基因：我們

10、采用一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR直接從產(chǎn)生倉鼠抗小鼠CD3抗體2C11-145的雜交瘤中擴(kuò)增出VH和VL,測序正確后通過重疊PCR構(gòu)建2C11sCκ和2C11sCκtp,兩個(gè)PCR產(chǎn)物裝入pGEM-Teasy載體擴(kuò)增。 2.構(gòu)建2C11sCκ和2C11sCκtp表達(dá)載體：我們用HindⅢ和EcoRI雙酶切上述pGEM-Teasy載體獲得2C11sCk和2C11sCktp片段,然后裝入經(jīng)相同酶切的pcDNA3.1(+)中成功構(gòu)建出含上述兩個(gè)

11、基因的表達(dá)載體。 第二部分：表達(dá)和純化2C11sCk和2C11sCktp蛋白 1.表達(dá)2C11sCk和2C11sCktp蛋白：抽提上述構(gòu)建的表達(dá)載體質(zhì)粒,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO,72h后收獲上清,通過流式檢測與表達(dá)小鼠CD3的YAC-1淋巴瘤細(xì)胞的結(jié)合表明2C11sCk和2C11sCktp蛋白構(gòu)象正確,結(jié)合活性良好,在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)行了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,篩選出了兩株穩(wěn)定高表達(dá)2C11sCk：和2C11sCktp蛋白的CHO細(xì)胞克隆。

12、 2.純化2C11sCk和2C11sCktp蛋白：大量擴(kuò)增CHO細(xì)胞克隆,收集細(xì)胞上清,采用Ni++離子金屬鰲合層析純化目的蛋白。SDS-PAGE和WB實(shí)驗(yàn)顯示純化的蛋白為單一條帶,純度90％以上,分子量與預(yù)期相符。純化的2C11sCk和2C11sCktp蛋白體外顯示良好的小鼠CD3結(jié)合活性。 第三部分：鑒定小鼠Foxp3基因特異高效的siRNA 1.構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)鼠Foxp3的細(xì)胞系：因?yàn)檗D(zhuǎn)染小鼠T細(xì)胞很困難,因此

13、我們需要構(gòu)建表達(dá)鼠Foxp3的易于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。我們利用表達(dá)鼠Foxp3的MIGR1-MFoxp3逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HELA細(xì)胞成功構(gòu)建了高表達(dá)鼠Foxp3的細(xì)胞系(HELA-MF),半定量、實(shí)時(shí)定量PCR和WB證實(shí)其高表達(dá)鼠Foxp3。 2.篩選鼠Foxp3特異高效的siRNA：利用HELA-MF細(xì)胞,我們針對QIAGEN公司合成的3個(gè)鼠Foxp3特異的siRNA進(jìn)行了篩選,發(fā)現(xiàn)siRNA A沉默效果最佳,因此,后續(xù)研究中我們主要

14、使用siRNAA驗(yàn)證單鏈抗體介導(dǎo)的siRNA遞送抑制Foxp3的效果。 第四部分：2C11sCktp蛋白遞送siRNA 1.2C11sCktp蛋白把FAM熒光表達(dá)的siRNA特異遞送至CD3+細(xì)胞：這部分結(jié)果顯示2C11sCktp蛋白能夠與CD3分子和FAM-siRNA結(jié)合,把后者特異遞送至CD3+YAC-1、EL-4鼠T淋巴瘤細(xì)胞和新鮮分離的小鼠T細(xì)胞中,而不是表達(dá)人CD3的Jurkat T細(xì)胞中。此外,注射2C11s

15、Cktp蛋白與FAM-siRNA形成的復(fù)合物至小鼠體內(nèi),6h后流式檢測小鼠脾細(xì)胞不同亞群的熒光攝取,發(fā)現(xiàn)只有CD3+T細(xì)胞檢測到FAM熒光的存在,而CD14+單核細(xì)胞、CO19+B細(xì)胞及CD11c+DC胞內(nèi)無FAM-siRNA存在。 2.2C11sCktp蛋白遞送的Foxp3特異的siRNA沉默了自然Treg和TGF-β誘導(dǎo)的Treg中Foxp3的表達(dá)：研究表面,Foxp3特異的siRNA能有效被2C11sCktp蛋白而不是對照

16、2C11sCk蛋白遞送至上述兩種Treg中,實(shí)時(shí)定量PCR、WB和胞內(nèi)Foxp3直接染色都證實(shí)Foxp3的表達(dá)下調(diào)。 第五部分:Foxp3表達(dá)沉默后Treg的表型和功能變化 1.Foxp3表達(dá)沉默后Treg的表型：結(jié)果表明,隨著Foxp3表達(dá)下調(diào),Foxp3調(diào)控的相關(guān)基因表達(dá)也發(fā)生改變,CD25、CTLA4和GITR等表面標(biāo)記分子表達(dá)下降,而IL-2、IL-7Rα和PDE3B等受Foxp3抑制的基因表達(dá)上調(diào)。 2

17、.Foxp3表達(dá)沉默后Treg的功能：結(jié)果顯示,低表達(dá)Foxp3的Treg功能發(fā)生改變,體外受CD3和CD28雙抗刺激后發(fā)生強(qiáng)力增殖,并分泌IL-2,IFN-γ和TNF-α等Th1細(xì)胞因子。這部分的結(jié)果提示沉默F(xiàn)oxp3表達(dá)后Treg的表型和功能向Th1逆轉(zhuǎn)。 第六部分：應(yīng)用siRNA相關(guān)的干擾素免疫應(yīng)答 體內(nèi)外研究都表明利用2C11sCktp蛋白遞送siRNA不會促發(fā)干擾素等非特異炎癥免疫應(yīng)答。 結(jié)論：