放療對BALB-c小鼠乳腺癌模型腫瘤微環(huán)境中Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(TREG)的影響的實驗研究.pdf

1、目的:在腫瘤的局部微環(huán)境中存在多種類型的免疫抑制細(xì)胞,其中CD4+CD25+Treg細(xì)胞是機體內(nèi)的一種能夠分泌多種細(xì)胞因子(TGF-β、IL-4、IL-10等)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,對效應(yīng)性T細(xì)胞具有免疫抑制作用,并且在介導(dǎo)腫瘤的免疫耐受和免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。本研究擬通過觀察放療對腫瘤微環(huán)境中的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg細(xì)胞)的影響及其與放療效果的相關(guān)性,以期為臨床以清除CD4+CD25+Treg細(xì)胞為基礎(chǔ)的

2、抗腫瘤免疫治療提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 進(jìn)行4T1乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng),購買BALB/c小鼠,建立BALB/c小鼠荷4T1細(xì)胞(小鼠乳腺癌)模型。將培養(yǎng)的4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞接種于BALB/c小鼠胸壁5-6肋間皮下(2×105細(xì)胞/只),固定小鼠四肢于平板上,將照射野縮小到略超出腫瘤大小范圍,用加速電壓6mV;組織劑量6000cGy;計量率500cGy/分;波長100cm的放療劑量為小鼠腫瘤進(jìn)行局部照射,每只小鼠行單

3、次治療,于放療前、后4、8、12天,取腫瘤組織及腫瘤周圍正常組織行石蠟包埋、切片、脫蠟、水化,應(yīng)用免疫組化試劑盒,SP法行免疫組化染色,檢測腫瘤組織及其周圍組織內(nèi)Foxp3的表達(dá)。取腫瘤組織,行200目銅網(wǎng)研磨制備腫瘤細(xì)胞懸液,行流式細(xì)胞染色,檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg含量。CellQuest軟件分析,以CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+Treg的比例反映Treg的含量,觀察特定放射治療劑量下調(diào)荷瘤鼠腫瘤

4、組織及腫瘤周圍組織中Treg含量的治療效果。
　　 結(jié)果:
　　 1：瘤體和淋巴結(jié)體積及生長速度在放療后明顯下降通過每4天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑(a)、短徑(b)、按體積(V)=πab2/6計算腫瘤體積,并計算腫瘤生長抑制率。對荷瘤小鼠的腫瘤進(jìn)行局部放射治療,分別觀察放療后4、8、12天后,腫瘤的體積大小及生長速度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著放療時間的延長,放療組與對照組相比,腫瘤的體積大小及生長速度都明顯變小減慢。
　　

5、2：放療使腫瘤組織內(nèi)Foxp3的表達(dá)水平降低于放療前、后4、8、12天,分別取腫瘤組織及腫瘤周圍正常組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,檢測腫瘤組織及其周圍組織內(nèi)Foxp3的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著天數(shù)增加,放療前腫瘤組織中Foxp3的表達(dá)高于正常組織,放療后的腫瘤組織與放療前的腫瘤組織相比,Foxp3的表達(dá)水平明顯下降。以上結(jié)果表明,在腫瘤組織中Foxp3的表達(dá)水平較正常組織增高,放療可使腫瘤組織中Foxp3的表達(dá)降低。
　　 3：放療使腫

6、瘤組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg含量降低應(yīng)用流式細(xì)胞染色及CellQuest軟件分析,計算小鼠在制模成功后的第1天及第8天時及放療后CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+Treg的比例,從而檢測Treg的含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在荷瘤小鼠的瘤體和淋巴結(jié)內(nèi),CD4+CD25+Foxp3+Treg的水平均在制模成功后的第1天稍見升高,而制模后第8天水平明顯升高。而放療組的與荷瘤組相比,CD4+CD25+Foxp3+Tr

7、eg的水平明顯降低。以上結(jié)果表明,在荷瘤早期和晚期的腫瘤組織和引流的淋巴結(jié)中,CD4+CD25+Foxp3+Treg含量(7.07±0.35)明顯增加(P＜0.05),放療使腫瘤組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg含量水平降低。
　　 結(jié)論:
　　 1：瘤體和淋巴結(jié)體積及生長速度在放療后明顯下降；
　　 2：放療使腫瘤組織內(nèi)Foxp3的表達(dá)水平降低；
　　 3：放療使腫瘤組織中CD4+CD25+F