CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞在α-干擾素治療小鼠肝纖維化中的作用.pdf

1、α-干擾素(Interferon-alpha，IFN-α)是由白細胞、成纖維細胞和病毒感染的組織細胞產(chǎn)生并分泌的一類具有多種生物活性的糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 肝纖維化（Hepatic fibrosis）是繼發(fā)于肝臟炎癥或損傷后組織修復過程中的代償性反應，是一切慢性肝病的共同病理基礎，也是向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)，其實質(zhì)是組織發(fā)生修復反應時ECM合成、降解與沉積不平衡而引起的病理過程，肝纖維化最終可發(fā)展

2、為肝硬化甚至肝癌。肝臟是一個免疫器官，多種免疫細胞及細胞因子均參與肝臟炎癥及肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。
　　 四氯化碳(CCl4)致使小鼠肝纖維化為探討IFN-α抗小鼠肝纖維化免疫應答機制提供了一個寶貴的實驗動物模型。在CCL4導致的肝臟慢性炎癥階段，炎癥反應和組織修復循環(huán)交替、HSC持續(xù)激活、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與分解代謝失衡，過度沉積于肝臟，導致肝纖維化。用藥物總體調(diào)節(jié)肝臟的免

3、疫微環(huán)境，誘導免疫細胞向逆轉(zhuǎn)肝纖維化的功能方向發(fā)展，可能成為治療肝纖維化的一種新思路，對闡明肝纖維化發(fā)病機制及探索肝纖維化治療靶點具有重要意義。
　　 我們利用成功建立的小鼠肝纖維化模型，動態(tài)觀察IFN-α不同劑量組在不同治療周期對小鼠模型肝臟的影響，以及免疫效應細胞的變化，探討α-干擾素治療肝纖維化的最佳劑量及機制。
　　 方法:
　　 1、實驗動物及主要試劑
　　 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠由中

4、國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供(許可證編號:SCXK京200420001);四氯化碳(CC14):分析純，上海長江化工廠;橄欖油:山東魯花集團產(chǎn)品;注射用重組人IFN-α2b:購自美國先靈葆雅，批號:010L30201;兔抗小鼠I型膠原多克隆抗體，購自ABCAM公司;流式單克隆抗體:購自美國BD公司。
　　 2、動物模型制作、分組及相應處理
　　 (1)除10只正常組小鼠外，每只腹腔注射10％ CC14（橄欖油稀釋）5u

5、l/g，3次/周，共8周（前兩次注射劑量減半）。
　　 (2)正常對照組(n=10):不予處理;生理鹽水對照組(n=9):0.9％生理鹽水100ul/只皮下注射，隔日一次;低劑量IFN-α治療組(n=8)，400U/只皮下注射:中劑量IFN-α治療組(n=8)，800U/只皮下注射;高劑量IFN-α治療組(n=9)，1200U/只，皮下注射，隔日一次（前三次劑量減半）。在治療3周和六周時，做相關實驗。
　　 注明:臨床上

6、針對病人的治療劑量:100萬/50kg、200萬/50kg、300萬/50kg，換算成小鼠按每只20g計算，從而得出低劑量組、中劑量組和高劑量組。
　　 3、病理檢查
　　 殺鼠取其肝臟，在肝左葉組織同部位取2塊，每塊組織約1cm×1cm×0.5cm大小，立即放入10％甲醛溶液中固定保存，備檢。切片做病理HE染色、MASSON染色以及Ⅰ型膠原染色。
　　 4、流式細胞儀檢測小鼠肝臟及脾臟細胞
　　 FAC

7、S檢測CD8+T細胞、活化T細胞、Tregs。
　　 5、統(tǒng)計學分析
　　 統(tǒng)計學分析使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，不同組之間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA分析)，同質(zhì)比較采用配對t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義，肝臟內(nèi)免疫細胞數(shù)量與肝纖維化評分的關系采用直線相關分析。
　　 實驗結果:
　　 1、IFN-α對肝纖維化小鼠肝組織病理的影響
　　 造模成功與否判斷:

8、造模6周及8周后分別取2只鼠，取肝臟做病理HE染色驗證其肝纖維化模型是否成功。匯管區(qū)周圍纖維化明顯，有芒狀纖維和纖維間隔形成。中度肝纖維化形成即可。（纖維隔形成并互相連接深入小葉內(nèi)，小葉結構保留或紊亂，但無肝硬化。）
　　 與生理鹽水組相比，IFN-α高、中及低劑量治療組肝組織纖維化程度好轉(zhuǎn)，尤其是中劑量治療組療效在治療六周時最為顯著。
　　 2、I型膠原免疫組化染色結果
　　 正常對照組小鼠肝臟Ⅰ型膠原主要表達

9、在匯管區(qū)，以及肝竇周圍，其他肝臟實質(zhì)區(qū)域基本無陽性表達;生理鹽水對照組，膠原布滿視野，膠原交連呈網(wǎng)狀，破壞了正常肝小葉結構;中劑量IFN-α治療后肝組織膠原沉積有明顯減少，陽性表達基本恢復正常。Ⅰ型膠原的光密度值，中劑量治療組和生理鹽水組有顯著的差異。
　　 3、IFN-α對肝纖維化小鼠治療過程中免疫細胞的變化
　　 中劑量IFN-α治療后，CD8+T細胞的數(shù)量較生理鹽水對照組有顯著的降低，而CD4+CD25+Foxp3