體外觀察Foxp3及IL-10在人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞中的作用.pdf

1、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T cells,Tregs)是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在防止自身免疫,保持機體的自身耐受性中發(fā)揮著決定性作用。到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種Tregs存在,其中CD4+Treg研究最為廣泛,包括CD4+CD25+Tregs,Tr1細胞,Th3細胞,CD4+CD103+T細胞和CD4+CD25-Tregs。CD4+CD25+Treg細胞是目前研究最多的一類調(diào)節(jié)性T細胞。天然存在的CD4+CD25+Tr

2、eg(nTreg)約占CD4+細胞的5％～10％,通過細胞一細胞接觸,分泌產(chǎn)生IL-10、TGF-β1及CTLA-4等細胞因子及共刺激分子,進而抑制T細胞、B細胞的分化及功能,是誘導(dǎo)和維持外周免疫耐受的重要細胞。該群細胞表達轉(zhuǎn)錄因子FoxP3(forkhead box p3)、CD45RBlow、CD62L、CD103、細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(GITR)等。
　　 CD4+CD

3、25+Tregs作為一類調(diào)節(jié)性細胞,在抑制自身反應(yīng)性細胞增殖,維持免疫環(huán)境的穩(wěn)定方面起著重要作用。CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量的減少、抑制功能的受損和(或)表面分子表達的缺陷,都可能導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)生。在大量糖尿病的動物模型和1型糖尿病患者的研究中均發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg細胞的缺陷。另外,腫瘤患者外周血CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量明顯增多,并且在腫瘤浸潤淋巴細胞或腫瘤相關(guān)淋巴細胞中,CD4+CD25+Treg細胞數(shù)

4、量也明顯增多。實驗研究中也多將CD4+、CD25+、FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞數(shù)量的變化作為免疫激活劑和抗腫瘤治療作用評價的觀察指標之一。在同種/異種器官和/或細胞移植免疫中,CD4+CD25+Treg細胞在免疫耐受中發(fā)揮重要的作用。Cohen等實驗證明去除移植物中CD4+CD25+T細胞加重移植物抗宿主病(GVHD),移植物中同時加入來自供鼠的新鮮分離的CD4+CD25+T細胞減輕GVHD。
　　 轉(zhuǎn)錄因子Foxp3特異地高

5、表達于CD4+CD25+Treg細胞內(nèi),是叉頭/翼狀2螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的一個新成員。其最初的發(fā)現(xiàn)源于對免疫缺陷病Scurfy小鼠的研究。Scurfy小鼠患有一種X-連鎖隱性遺傳病,這種疾病由異?；罨腃D4+T細胞介導(dǎo),產(chǎn)生大量的細胞因子,造成對自身組織器官的損害。Brunkow于2001年在scurfy小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了Foxp3基因的突變,突變基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物scurfin缺失功能性forkhead結(jié)構(gòu)域,從而不能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制因子的功

6、能。類似的突變異常也出現(xiàn)在人類免疫失調(diào)-多發(fā)性內(nèi)分泌腺病-腸病-X連鎖綜合征(Immunodysregtnation,Polyendocrinopathy,Enteropathy,X-linkedsyndrom,IPEX),從而提示Foxp3基因在免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中的重要作用。對嚙齒類動物的研究中,Foxp3對的關(guān)鍵作用已經(jīng)得到公認,Foxp3特異的表達于調(diào)節(jié)性T細胞,并控制著調(diào)節(jié)性T細胞的發(fā)展和功能。但是在人類,Foxp3對CD4+CD2

7、5+Treg細胞的調(diào)節(jié)作用尚存在許多爭議,有研究證明在CD4+CD25-Foxp3-T細胞中誘導(dǎo)Foxp3表達并不能使這些細胞具備調(diào)節(jié)性T細胞的抑制功能,而且活化的非抑制性T細胞表面發(fā)現(xiàn)有Foxp3的表達,這就使得人們對Foxp3在Tregs中的作用產(chǎn)生了質(zhì)疑。目前,體外擴增Tregs已經(jīng)成為可能,進一步擴增的Tregs將被用于臨床治療一些自身免疫性疾病或者預(yù)防移植排斥,這樣更加要求我們明確是哪個因子調(diào)控著Treg細胞的表面標志和抑制功

8、能。
　　 目前對CD4+CD25+T細胞介導(dǎo)的免疫抑制作用的效應(yīng)機制還不明確,實驗結(jié)果也存在著矛盾。有些實驗支持CD4+CD25+Treg細胞是通過與細胞接觸發(fā)揮抑制作用；另一些研究表明CD4+CD25+T細胞也可通過分泌細胞因子(IL-10,TGF-β)而介導(dǎo)抑制效應(yīng)。我們以前的研究證實,在異種免疫反應(yīng)中,擴增Tregs增強的抑制功能伴隨著細胞因子IL-10的增加,表明了IL-10在異種免疫反應(yīng)中有重要作用,但具體的作用機制

9、仍不明確。但目前關(guān)于IL-10在Treg介導(dǎo)的抑制作用中究竟有無作用仍不明確。
　　 在本研究利用RNA干擾技術(shù)分別抑制Foxp3和IL-10基因表達,觀察Foxp3和IL-10是否有助于維持體外擴增的人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的抑制性表型標志、功能基因及Treg介導(dǎo)的對異種/同種異體刺激的效應(yīng)性T細胞的增殖反映的抑制作用。
　　 第一部分 Foxp3在人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞中的作用
　　

10、 研究目的:通過抑制Foxp3基因表達,觀察其對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表型及抑制功能的影響。
　　 研究方法:1.調(diào)節(jié)性T細胞的分離和體外培養(yǎng)。根據(jù)人CD4+CD25+淋巴細胞分離試劑盒分離人Tregs。并按照實驗室成熟的擴增方法培養(yǎng)細胞2-3周后用于下一步試驗。2.SiRNA轉(zhuǎn)染:公司合成的Foxp3 siRNA與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合體轉(zhuǎn)染至擴增的Tregs。非特異性siRNA轉(zhuǎn)染的Tregs和未傳染的Tregs作為對照組。

11、3.采用實時定量PCR(realtime-PCR)和Western blotting、免疫熒光法分別檢測Foxp3基因和蛋白的表達。實時定量PCR檢測Tregs功能相關(guān)基因表達。4.流式細胞儀觀察Tregs表型的改變。5.ELISA測定Tregs及活化的效應(yīng)性CD4+CD25-T細胞分泌的細胞因子水平。6.增殖抑制試驗:各組Tregs與同一個體的效應(yīng)性CD4+CD25-T細胞,及其異種(豬)或同種異體(人)的外周血單個核細胞(PBMC)

12、共培養(yǎng)5天,觀察Tregs對效應(yīng)性CD4+CD25-T細胞增殖的抑制功能變化。7.細胞毒性試驗:分離以上共培養(yǎng)體系中的效應(yīng)性CD4+CD25-T細胞,再與異種或同種異體PBMC共培養(yǎng)后,觀察目標PBMC的調(diào)亡情況。7.統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)論:Foxp3 siRNA成功轉(zhuǎn)染到人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞內(nèi),并引起了基因抑制,蛋白表達減少。Foxp3基因抑制導(dǎo)致了Tregs表型標志表達改變,相關(guān)功能基因表達下調(diào),對抑制效應(yīng)

13、性T細胞增殖的功能下降,抑制性細胞因子分泌下降,以及對抑制效應(yīng)性T細胞產(chǎn)生的效應(yīng)性細胞因子的作用減弱。通過以上結(jié)果證實不論在異種免疫反應(yīng)還是同種免疫反應(yīng)中,Foxp3是人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
　　 第二部分 IL-10在人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞中的作用
　　 研究目的:通過抑制IL-10基因表達,觀察其對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表型及抑制功能的影響。
　　 研究方法

14、:1.調(diào)節(jié)性T細胞的分離和體外培養(yǎng)。2.siRNA轉(zhuǎn)染:公司合成的IL-10 siRNA與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合體轉(zhuǎn)染至擴增的Tregs；非特異性siRNA轉(zhuǎn)染的Tregs和未傳染的Tregs作為對照組。3.采用實時定量PCR(realtime-PCR)和Western blotting分別檢測IL-10基因和蛋白的表達。實時定量PCR檢測Tregs功能相關(guān)基因的表達。4.流式細胞技術(shù)觀察Tregs表型的改變。5.ELISA測定Tresg及活化

15、的效應(yīng)性CD4+CD25-T細胞分泌的細胞因子。6.增殖抑制試驗:各組Treg與同一個體的效應(yīng)性CD4+CD25-T細胞,及其異種(豬)或同種異體(人)的單個核細胞共培養(yǎng)5天,觀察Treg對效應(yīng)性CD4+CD25-T細胞增殖的抑制功能變化。利用transwell小室非接觸式共培養(yǎng)的方法將以上細胞共培養(yǎng)后同樣觀察效應(yīng)性CD4+CD25-T細胞增殖變化。在以上共培養(yǎng)體系中加入重組人白細胞介素10(rhIL-10),觀察其對效應(yīng)性CD4+CD

16、25-T細胞增殖的作用及對減低的Treg抑制功能的逆轉(zhuǎn)作用。7.統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)論:IL-10 siRNA成功轉(zhuǎn)染到人天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞內(nèi),并引起了基因抑制,蛋白表達減少。IL-10基因抑制沒有影響Tregs表型標志表達,相關(guān)功能基因表達,Tregs對效應(yīng)性T細胞分泌效應(yīng)因子的抑制作用以及Tregs自身分泌抑制性細胞因子TGF-β。功能實驗表明IL-10基因抑制降低了Tregs對異種抗原刺激的效應(yīng)性CD4+