RNA干擾沉默大鼠椎間盤(pán)細(xì)胞Fas基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、椎間盤(pán)退變性疾病(degenerative disc disease，DDD)是以椎間盤(pán)變性、椎體力學(xué)性能異常為始發(fā)因素的一個(gè)連續(xù)過(guò)程。由椎間盤(pán)退變而致的下腰痛(Low back pain，LBP)是現(xiàn)代社會(huì)中的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題。我國(guó)人口眾多，且社會(huì)老齡化逐年加劇，重視退變性椎間盤(pán)疾病的研究與治療具有重要意義。 引起椎間盤(pán)退變的原因是多方面、多層次的。目前，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在椎間盤(pán)的衰老和退變中起重要作用，而Fas/Fas

2、L系統(tǒng)可能是椎間盤(pán)細(xì)胞主要的凋亡途徑。因此打斷Fas/FasL系統(tǒng)，減少椎間盤(pán)細(xì)胞的凋亡有望成為阻止椎間盤(pán)退變的手段。利用RNAi手段可以特異性地抑制相應(yīng)基因序列的表達(dá)，從而有望達(dá)到阻斷細(xì)胞的凋亡的目的。但有關(guān)的利用RNAi手段阻斷椎間盤(pán)細(xì)胞凋亡的研究未見(jiàn)報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成針對(duì)SD大鼠Fas基因的siRNA，轉(zhuǎn)染椎間盤(pán)細(xì)胞并與FasL(Fas Ligand)共培養(yǎng)，觀察經(jīng)Fas-siRNA轉(zhuǎn)染的椎間盤(pán)細(xì)胞Fas基因和蛋白表

3、達(dá)水平及細(xì)胞凋亡的變化，探討能否利用RNAi手段阻斷椎間盤(pán)細(xì)胞凋亡。 第一部分：SD大鼠腰椎間盤(pán)細(xì)胞的培養(yǎng)效率 目的：探討SD大鼠腰椎間盤(pán)內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細(xì)胞的培養(yǎng)方法。 方法：用酶消化法分離培養(yǎng)SD大鼠腰椎間盤(pán)內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細(xì)胞，經(jīng)倒置顯微鏡觀察、甲苯胺藍(lán)、番紅O染色和膠原Ⅱ免疫組化鑒定確定培養(yǎng)細(xì)胞類(lèi)型。 結(jié)果：培養(yǎng)的椎間盤(pán)細(xì)胞經(jīng)鑒定為類(lèi)軟骨細(xì)胞。 結(jié)論：用酶消化法

4、可成功培養(yǎng)大鼠腰椎間盤(pán)內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細(xì)胞，細(xì)胞類(lèi)型為類(lèi)軟骨細(xì)胞。 第二部分：針對(duì)大鼠腰椎間盤(pán)細(xì)胞Fas基因的siRNA有效序列篩選 目的：探討化學(xué)合成的Fas-siRNA能否對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠腰椎間盤(pán)細(xì)胞Fas基因進(jìn)行有效沉默。 方法：利用化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染單層培養(yǎng)的椎間盤(pán)細(xì)胞。以優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染，通過(guò)FAM熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染率；另分六組：空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)

5、染，無(wú)效序列siRNA轉(zhuǎn)染組為陰性對(duì)照組，針對(duì)GAPDH的siRNA轉(zhuǎn)染組為陽(yáng)性對(duì)照組，三條Fas-siRNA轉(zhuǎn)染組分別為Fas-siRNA1組、Fas-siRNA2組、Fas-siRNA3組。轉(zhuǎn)染后在不同時(shí)間點(diǎn)分別觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞活性，檢測(cè)mRNA及蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：以優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染大鼠腰椎間盤(pán)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率最高可達(dá)94.4％；化學(xué)合成的Fas-siRNA2能抑制體外培養(yǎng)的大鼠腰椎間盤(pán)細(xì)胞Fas基因、蛋白的表達(dá)，48

6、小時(shí)達(dá)最低可分別達(dá)79.2％、71.3％。維持時(shí)間至少達(dá)72小時(shí)。 結(jié)論：化學(xué)合成的Fas-siRNA能對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠腰椎間盤(pán)細(xì)胞Fas基因進(jìn)行有效沉默。以優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染大鼠腰椎間盤(pán)細(xì)胞可獲很高的轉(zhuǎn)染率和抑制效果。 第三部分：不同劑量FasL對(duì)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染椎間盤(pán)細(xì)胞凋亡的影響 目的：探討重組大鼠FasL對(duì)在體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染Fas-siRNA2大鼠腰椎間盤(pán)細(xì)胞的凋亡作用和Fa的基因和蛋白表達(dá)。 方

7、法：對(duì)單層培養(yǎng)的大鼠腰椎問(wèn)盤(pán)內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染和不轉(zhuǎn)染Fas-siRNA2，各設(shè)三組：三個(gè)轉(zhuǎn)染組和三個(gè)未轉(zhuǎn)染組各分別加入含不同濃度的FasL(0ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)的1％FBS培養(yǎng)基共培養(yǎng)。24小時(shí)后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組凋亡率，RT-PCR評(píng)估Fas基因表達(dá)，Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。 結(jié)果：三個(gè)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率均隨著FasL濃度的增加而增加；但相同濃度的