利用rna干擾誘導ace基因沉默治療自發(fā)性高血壓大鼠的研究

1、山西醫(yī)科大學博士學位論文利用RNA干擾誘導ACE基因沉默治療自發(fā)性高血壓大鼠的研究姓名：何軍華申請學位級別：博士專業(yè)：心血管內科指導教師：肖傳實20070528lIJ西醫(yī)科丈學博士學位論文因，故轉染后48小時可在熒光顯微鏡下觀察熒光表達并計算轉染效率，同時用MTT法檢測細胞存活率，尋求轉染效率較高且細胞毒性較低的pACEshRNA與METAFECTENE的最佳配比。3質粒pACEshRNA抑制大鼠血管內皮細胞ACE表達的研究：用pACE

2、shRNA與METAFECTENE的最佳配比復合物轉染大鼠血管內皮細胞，分別于轉染前及轉染后的24h、48h、72h收集細胞，用RTPCR及Westernblot法檢測ACEmRNA及相應功能蛋白的表達。大鼠血管內皮細胞分為四組：①空白對照組(細胞內不加任何干擾因素)；②質粒對照組(細胞轉染對照質粒)；③pACEshRNAI組(細胞轉染pACE。shRNAl)；④pACEshRNA2組(細胞轉染pACEshRNA2)。4構建靶向抑制大鼠

3、ACE基因的shRNA重組腺病毒載體：利用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)，自先期構建的pACEshRNA真核表達載體中酶切出ACEshRNA片段，克隆入穿梭質粒pDC316中，然后將穿梭質粒pDC316EGFPACEshRNAU6和腺病毒骨架質粒paHGIox_E1，3Cre共轉染293細胞，包裝成重組的腺病毒載體Ad5EGFPACEshRNA并擴增、純化、鑒定。5腺病毒介導的ACEshRNA對自發(fā)性高血壓大鼠的治療作用：自發(fā)性高血壓大鼠隨機

4、分為三組：①空白對照組(尾靜脈注射生理鹽水)；②病毒對照組(尾靜脈注射對照腺病毒Ad5一EGFP)；③治療組(尾靜脈注射Ad5EGFPACEshRNA)；同時設正常血壓對照組(尾靜脈注射生理鹽水)。以上各組大鼠均注射兩次，注射時間均為實驗的第1天和第16天。實驗期間做以下檢測：①注射前后檢測血壓、心率的變化。②首次注射后第3天，取治療組大鼠心肌、主動脈、腎臟組織，做冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察腺病毒載體吸收情況。③首次注射后第3天，心臟體

5、外采血用ELISA法檢測各組大鼠血清中ACE的含量，并且用RTPCR及Westernblot法檢測心肌、主動脈、腎臟組織中ACEmRNA及相應功能蛋白的差異表達。④實驗結束時，取各組大鼠心肌，做光鏡及電鏡切片，并檢測大鼠全心／體重、左心室／體重，及心肌羥脯氨酸、膠原蛋白的含量，以觀察心肌重構的變化。同時采血檢測肝腎功能。結果1經DNA測序和酶切鑒定，證明我們構建的靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA真核表達載體一重組質粒pACEshRNA

6、l與pACEshRNA2無基因突變，符合實驗要求。2①植塊培養(yǎng)3天左右倒置相差顯微鏡觀察即可發(fā)現(xiàn)有內皮細胞從組織塊周圍移出，大約10天左右細胞開始融合成片，呈“鋪路石樣”。傳代培養(yǎng)的細胞和原代形態(tài)相似，生長較快，4～5天可以融合成單層，大概傳3～4代左右時，細胞開始變性變形、脫落，不再繼續(xù)生長。用免疫熒光法鑒定可見胞漿內有大量綠色熒光表達。②根據(jù)轉染效率以及細胞生存率測定結果，篩選出質粒與轉染試劑復合物的最佳配比為pACEshRNA10