利用RNA干擾誘導(dǎo)ACE基因沉默治療自發(fā)性高血壓大鼠的研究.pdf

1、高血壓是充血性心衰、中風(fēng)、終末期腎病的重要危險(xiǎn)因子。尋找一種長期有效的、通過調(diào)節(jié)體內(nèi)基因表達(dá)而控制高血壓的方法即基因治療一直是醫(yī)學(xué)家們努力的目標(biāo)和方向。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是近年發(fā)展起來的基因阻斷技術(shù)，該技術(shù)通過雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)的介導(dǎo)，在酶的作用下產(chǎn)生大量的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，特異性降解與

2、之序列同源的mRNA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。研究表明當(dāng)siRNA呈短發(fā)夾狀RNA(short hairpin RNA，shRNA)時(shí)，其基因沉默效應(yīng)更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)即利用先進(jìn)的RNA干擾技術(shù)，選擇與高血壓病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin.angiotensin system，RAS)中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)為靶點(diǎn)，構(gòu)建ACE-shKNA的表達(dá)載體，分別

3、在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用該技術(shù)抑制ACE mRNA的表達(dá)，從而探索其在高血壓治療中的應(yīng)用前景。 方法： 1.構(gòu)建靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA真核表達(dá)載體：首先在GenBank上選取大鼠ACE mRNA序列，根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)兩條靶序列，并進(jìn)行BLAST驗(yàn)證。然后合成靶序列單鏈并退火形成雙鏈，與線性化pGenesil-1質(zhì)粒載體連接，進(jìn)行酶切和測序鑒定。構(gòu)建的兩個(gè)重組質(zhì)粒分別命名為pACE-shRNA1與pA

4、CE-shRNA2。 2.質(zhì)粒pACE-shRNA轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞條件的優(yōu)化：①植塊法原代培養(yǎng)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞：將Wistar大鼠(體重120～150g)頸椎脫臼處死，無菌狀態(tài)下取出其胸、腹主動(dòng)脈，剪切成約1mm×1mm大小的血管片，內(nèi)膜面壁貼于培養(yǎng)瓶內(nèi)，在含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行大鼠動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和生長特性，并進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞中Ⅷ因子相關(guān)抗原(von Will

5、ebrandfactor，vwF)的檢測鑒定。②用不同比例的質(zhì)粒pACE-shRNA與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑METAFECTENE的復(fù)合物轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞。因質(zhì)粒中含有綠色熒光蛋白的報(bào)告基因，故轉(zhuǎn)染后48小時(shí)可在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)用MTT法檢測細(xì)胞存活率，尋求轉(zhuǎn)染效率較高且細(xì)胞毒性較低的pACE-shRNA與METAFECTENE的最佳配比。 3.質(zhì)粒pACE-shRNA抑制大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE表達(dá)的研究：

6、用pACE-shRNA與METAFECTENE的最佳配比復(fù)合物轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h收集細(xì)胞，用RT-0PCR及Westem blot法檢測ACE mRNA及相應(yīng)功能蛋白的表達(dá)。大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞分為四組：①空白對照組(細(xì)胞內(nèi)不加任何干擾因素)；②質(zhì)粒對照組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒)；③pACE-shRNAl組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染pACE-shRNAl)；④pACE-shRNA2組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染pACE-shRNA

7、2)。 4.構(gòu)建靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA重組腺病毒載體：利用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)，自先期構(gòu)建的pACE-shRNA真核表達(dá)載體中酶切出ACE-shRNA片段，克隆入穿梭質(zhì)粒pDC316中，然后將穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-ACE-shRNA.U6和腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGlox_E1，3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝成重組的腺病毒載體Ad5-EGFP-ACE-shRNA并擴(kuò)增、純化、鑒定。 5.腺病毒介導(dǎo)的

8、-ACE-shRNA對自發(fā)性高血壓大鼠的治療作用：自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為三組：①空白對照組(尾靜脈注射生理鹽水)；②病毒對照組(尾靜脈注射對照腺病毒Ad5-EGFP)；③治療組(尾靜脈注射Ad5-EGFP-ACE-shRNA)；同時(shí)設(shè)正常血壓對照組(尾靜脈注射生理鹽水)。以上各組大鼠均注射兩次，注射時(shí)間均為實(shí)驗(yàn)的第1天和第16天。實(shí)驗(yàn)期間做以下檢測：①注射前后檢測血壓、心率的變化。②首次注射后第3天，取治療組大鼠心肌、主動(dòng)脈、腎臟組織

9、，做冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察腺病毒載體吸收情況。③首次注射后第3天，心臟體外采血用ELISA法檢測各組大鼠血清中ACE的含量，并且用RT-PCR及Western blot法檢測心肌、主動(dòng)脈、腎臟組織中ACE mRNA及相應(yīng)功能蛋白的差異表達(dá)。④實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取各組大鼠心肌，做光鏡及電鏡切片，并檢測大鼠全心/體重、左心室/體重，及心肌羥脯氨酸、膠原蛋白的含量，以觀察心肌重構(gòu)的變化。同時(shí)采血檢測肝腎功能。 結(jié)果： 1.經(jīng)DN

10、A測序和酶切鑒定，證明我們構(gòu)建的靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA真核表達(dá)載體—重組質(zhì)粒pACE-shRNAl與pACE-shRNA2無基因突變，符合實(shí)驗(yàn)要求。 2.①植塊培養(yǎng)3天左右倒置相差顯微鏡觀察即可發(fā)現(xiàn)有內(nèi)皮細(xì)胞從組織塊周圍移出，大約10天左右細(xì)胞開始融合成片，呈“鋪路石樣”。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞和原代形態(tài)相似，生長較快，4～5天可以融合成單層，大概傳3～4代左右時(shí)，細(xì)胞開始變性變形、脫落，不再繼續(xù)生長。用免疫熒光法鑒定可見胞

11、漿內(nèi)有大量綠色熒光表達(dá)。②根據(jù)轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞生存率測定結(jié)果，篩選出質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物的最佳配比為pACE-shRNA 1.0μgMETAFECTENE 4μl，此時(shí)轉(zhuǎn)染效率為81.2％，細(xì)胞生存率為90.2％，優(yōu)于其他條件時(shí)的轉(zhuǎn)染效率并能保證較低的細(xì)胞毒性，故作為我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的最佳選擇。 3.pACE-shRNAl組與pACE-shRNA2組在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)細(xì)胞內(nèi)ACE mRNA及相應(yīng)蛋白表達(dá)均明顯降低，與空白對照組和質(zhì)粒

12、對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，72小時(shí)表達(dá)更低(P<0.01)。兩組相比，pACE-shRNA2組的抑制作用更強(qiáng)一些。而空白對照組與質(zhì)粒對照組轉(zhuǎn)染前后各時(shí)間點(diǎn)ACE mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)無明顯變化。 4.經(jīng)限制性內(nèi)切酶、PCR檢測和熒光顯微鏡觀察，證實(shí)成功構(gòu)建了能夠表達(dá)ACE-shRNA的重組腺病毒載體并制備出高滴度的重組病毒。 5.①干預(yù)前SHR各組之間尾動(dòng)脈壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而SHR

13、各組均與正常血壓對照組有顯著性差異(P<0.01)。SHR治療組于首次注射后第3天，尾動(dòng)脈壓下降19mmHg±5mmHg，與治療前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，降壓作用可持續(xù)14天左右，最大降壓幅度達(dá)22mmHg，注射后第16天時(shí)血壓開始回升；第2次注射后，尾動(dòng)脈壓再次明顯下降20mmHg±6mmHg，降壓作用可持續(xù)15天左右，最大降壓幅度達(dá)21mmHg。而SHR空白對照組和病毒對照組尾動(dòng)脈壓持續(xù)升高，正常血壓對照組尾動(dòng)脈壓無明顯變

14、化。②熒光顯微鏡下可見心肌、主動(dòng)脈、腎臟組織的冰凍切片有大量綠色熒光表達(dá)，說明Ad5-EGFP-ACE-shRNA可被富含ACE的組織大量吸收。⑧SHR治療組大鼠血清ACE含量(16.37ng/ml±3.90g/ml)明顯低于空白對照組(48.26ng/ml±1.50ng/ml)與病毒對照組(46.67ng/ml±2.82ng/ml)，心肌、主動(dòng)脈、腎臟組織中ACE mRNA及相應(yīng)蛋白表達(dá)較空白對照和病毒對照組也明顯降低(P<0.05)

15、，而與正常血壓對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。④光鏡切片顯示治療組心肌細(xì)胞肥大明顯減輕，電鏡切片顯示治療組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯改善。左心室/體重之比與心肌膠原蛋白含量：治療組(2.24±0.19，1.283μg/mg±0.019μg/mg)顯著低于空白對照組(3.21±0.13，1.686tμg/mg±0.013μg/mg)與病毒對照組(3.13±0.12，1.682μg/mg±0.009μg/mg)，但還未降到正常血壓對照組水平(

16、2.06±0.11，1.25μg/mg±0.019μg/mg)。⑤整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠心率及肝腎功能均無明顯變化。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了以大鼠ACE基因?yàn)榘形坏恼婧吮磉_(dá)載體pACE-shRNA。 2.通過血管植塊的方法可以實(shí)現(xiàn)大鼠動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)并傳代，細(xì)胞純度在90％以上。經(jīng)過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑METAFECTENE可以將重組質(zhì)粒pACE-shRNA高效轉(zhuǎn)染入大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，并保證較低的

17、細(xì)胞毒性。 3.真核表達(dá)載體pACE-shRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞后可以有效地實(shí)現(xiàn)對靶基因mRNA的降解，進(jìn)而抑制相應(yīng)功能蛋白的表達(dá)。 4.成功構(gòu)建了能夠表達(dá)ACE-shRNA的重組腺病毒載體。 5.腺病毒介導(dǎo)的．ACE-shRNA注射入自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)后，成功發(fā)揮了基因沉默作用，有效抑制了ACE mRNA及相應(yīng)功能蛋白的表達(dá)，起到了明顯、持久的降壓作用，并且顯著改善了心肌重構(gòu)，同時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。因