小片段干擾RNA沉默Molt-4細(xì)胞DNMT1基因?qū)M蛋白調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:DNMT1小片段RNA干擾人急性T淋巴細(xì)胞性白血病Molt-4細(xì)胞的DNMT1(DNA methyltransferase 1)基因的表達(dá),研究DNMT1基因干擾對(duì)Molt-4細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及對(duì)組蛋白甲基化、乙?；{(diào)控的影響,探討白血病基因治療的新靶點(diǎn)。
　　方法:(1)設(shè)計(jì)針對(duì)DNMT1基因的4個(gè)小干擾RNA片段,經(jīng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染Molt-4細(xì)胞后,應(yīng)用RT-PCR篩選出最

2、佳DNMT1干擾片段。
　　(2)應(yīng)用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn),觀(guān)察DNMT1 siRNA對(duì)Molt-4細(xì)胞增殖的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的凋亡。
　　(3)應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測(cè)Bcl-2、procaspase-3、P15蛋白表達(dá)水平以及組蛋白H3K4、H3K9甲基化、組蛋白H3乙酰化狀態(tài)的改變。
　　結(jié)果:(1)人DNMT1最佳的siRNA序列為Sense 5'-GCACCUCAUUUGCCGAAUATT-3'

3、Antisense 5'-UAUUCGGCAAAUGAGGUGCTT-3'。DNMT1siRNA轉(zhuǎn)染Molt-4細(xì)胞后可沉默該基因表達(dá),并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。
　　(2)DNMT1 siRNA抑制Molt-4細(xì)胞增殖,且隨著濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng),抑制率也逐漸上升。
　　(3)DNMT1 siRNA下調(diào)Molt-4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、procaspase-3的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　(4)DNMT1 siRNA沉

4、默Molt-4細(xì)胞的DNMT1蛋白及DNMT1 mRNA表達(dá),上調(diào)P15的表達(dá);下調(diào)組蛋白H3K9甲基化水平,上調(diào)組蛋白H3K4的甲基化水平,而組蛋白H3乙酰化水平無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:(1)陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000介導(dǎo)DNMT1 siRNA導(dǎo)入Molt-4細(xì)胞,具有操作步驟簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)染率高的特點(diǎn)。
　　(2)運(yùn)用RNAi技術(shù),DNMT1 siRNA可以有效地抑制Molt-4細(xì)胞中DNMT1的表