shRNA靶向沉默DNMT1基因?qū)撬枇黾?xì)胞的增殖及抑癌基因甲基化的影響.pdf

1、目的:
　　 探討RNA干擾技術(shù)沉默DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)基因?qū)撬枇黾?xì)胞增殖能力、凋亡以及相關(guān)基因甲基化水平的影響，為明確骨髓瘤發(fā)病的分子機(jī)制及開(kāi)展去甲基化治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).
　　 方法:
　　 構(gòu)建靶向DNMT1基因的短發(fā)卡RNA(shRNA)真核表達(dá)載體，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞并經(jīng)嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，同時(shí)分別設(shè)立(1)空白對(duì)照組:人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226及

2、(2)陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒shRNA的control-shRNA;RT-PCR和Westernblot檢測(cè)各組細(xì)胞DNMT1mRNA和蛋白的表達(dá)情況;PI染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期改變;CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況;Westernblot法檢測(cè)周期、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化;甲基化特異性PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)甲基化水平的改變。
　　 結(jié)果:
　　 1.DNMT1cDNA序列符合實(shí)驗(yàn)要求，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;重組質(zhì)

3、粒高效并成功轉(zhuǎn)入RPMI8226細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的DNMT1mRNA和蛋白表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞百分比較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組兩組細(xì)胞明顯增加，S期和G2/M期的細(xì)胞百分比水平明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3.實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Bcl-2、NF-kB蛋白表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。
　　 4.實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞SOCS1及

4、P16基因甲基化水平明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過(guò)shRNA技術(shù)靶向沉默DNMT1基因可以顯著抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 2.靶向沉默DNMT1基因后腫瘤細(xì)胞增殖抑制與bcl-2、NF-kB表達(dá)水平減低有關(guān)。
　　 3.靶向沉默DNMT1基因可逆轉(zhuǎn)抑癌基因P16、SOCS-1的高甲基化狀態(tài)。
　　 4.DNMT1基因沉默可能成為新的治療多發(fā)性骨髓瘤的途