RNAi致DKK-1基因沉默的骨髓瘤細胞株對鼠胚胎成骨細胞分化的影響.pdf

1、目的：(1)建立RNAi后DKK-1基因長期沉默的人多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞RPMI8226細胞株；(2)研究RPMI8226細胞通過RNAi導致DKK-1基因沉默，DKK-1表達下降，減輕對小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1細胞分化成成骨細胞的抑制，初步探討DKK-1在MM骨損發(fā)病中的作用。 方法：(1)設計1對DKK-1miRNA前體DNA寡核苷酸引物，退火成雙鏈后克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR質粒，再通

2、過GatewayR技術進行基因轉移，得到重組質粒pLenti6/V5-GW/DKK-1-miR，與慢病毒包裝質粒一起經lipofectamineTMM2000轉染293FT細胞，48h后收獲細胞上清液獲得慢病毒，高速離心濃縮后感染RPMI8226細胞株，10μg/mlBlasticidin篩選12天得到DKK-1基因長期沉默的RPMI8226細胞株，RT-PCR檢測胞漿DKK-1mRNA表達和Western-blotting檢測濃縮50

3、倍的細胞上清液中DKK-1蛋白的表達來分析DKK-1RNAi效率：(2)將RPMI8226原細胞株、DKK-1RNAi的RPMI8226細胞株和無關序列RNAi的RPMI8226細胞株等3種細胞培養(yǎng)上清液以20％體積比的量分別加入BMP-2誘導的MC3T3-E1成骨樣細胞培養(yǎng)體系中，10天后觀察3者對MC3T3-E1細胞分化成成骨細胞的抑制效率，觀察指標為MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶(ALP)mRNA及活性的變化。 結果：(1

4、)293FT細胞轉染18小時后在熒光顯微鏡下整個培養(yǎng)板顯現(xiàn)滿視野綠色熒光，重組質粒轉染效率90％左右；(2)慢病毒高速離心濃縮15倍后感染NIH3T3細胞，48h表達增強型綠色熒光蛋白(EmGFP)，流式細胞術檢測NIH3T3細胞EmGFP表達率計算出慢病毒濃縮液滴度為3.89×105TU/ml；(3)分別用0、2、4、6、8、10μg/mlBlasticidin處理RPMI8226細胞12天，僅10μg/ml組沒有存活細胞存在；(4)

5、在8μg/mlPolybreneR作用下，0.5ml慢病毒濃縮液感染2×104個RPMI8226細胞，10μg/mlBlasticidin篩選12天后得到約2000個表達DKK-1shRNA的RPMI8226細胞克隆，細胞擴增后RT-PCR結果顯示DKK-1mRNA表達降低了86％，Western-blotting結果顯示DKK-1蛋白表達降低了88％；(5)MC3T3-E1細胞經50ng/mlBMP-2誘導10天后胞漿ALPmRNA表

6、達增強6.9倍，ALP活性增強7.1倍；(6)跟單BMP-2誘導組相比，加入20％體積比的RPMI8226細胞培養(yǎng)上清液能強烈抑制MC3T3-E1細胞分化，培養(yǎng)10天后MC3T3-E1細胞ALPmRNA表達僅增強了2.2倍，ALP活性增強2.4倍。20％體積比的含DKK-1shRNA的RPMI8226細胞培養(yǎng)上清液抑制MC3T3-E1細胞分化能力減弱，10天后MC3T3-E1細胞ALPmRNA表達增強5.2倍，ALP活性增強5.5倍，分

7、別跟單BMP-2誘導組和RPMI8226細胞組相比，差異均有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。20％體積比的無關序列RNAi的RPMI8226細胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)10天后MC3T3-E1細胞ALPmRNA表達增強2，3倍，ALP活性增強2.6倍。 結論：(1)基于慢病毒載體的RNAi有較高的基因抑制效率，但缺點是產生慢病毒滴度低，需濃縮后才能感染靶細胞；(2)MM細胞通過分泌DKK-1抑制胚胎成骨細胞分化成成骨細胞，導致MM體內成骨細胞活