沉默膜聯(lián)蛋白A1對兔骨髓間充質(zhì)干細胞和成骨細胞生物特性的影響.pdf

1、背景:激素性股骨頭缺血性壞死在臨床上較為常見，目前其發(fā)病機制尚不明確。研究表明，激素性股骨頭缺血性壞死與骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化能力轉(zhuǎn)變、成骨細胞凋亡增加相關(guān)。本實驗是國家自然科學(xué)基金資助項目“早期激素性股骨頭缺血性壞死的蛋白質(zhì)組學(xué)動態(tài)分析”的一部分，前部分實驗顯示，早期激素性股骨頭缺血性壞死動物模型股骨頭組織的骨細胞凋亡增加，膜聯(lián)蛋白A1表達下調(diào)，由此推測膜聯(lián)蛋白A1表達下調(diào)可能導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化能力降低、成骨細

2、胞凋亡增加。膜聯(lián)蛋白A1是一種鈣依賴的磷脂結(jié)合多功能蛋白，參與細胞分化及細胞凋亡的調(diào)控。然而，目前有關(guān)膜聯(lián)蛋白A1基因表達水平的改變與激素性股骨頭缺血性壞死發(fā)生之間的關(guān)系尚未明確，且未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的文獻報道。
　　本研究分三部分。
　　第一部分兔膜聯(lián)蛋白A1基因短發(fā)夾RNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定
　　目的:針對兔膜聯(lián)蛋白A1基因構(gòu)建短發(fā)夾RNA慢病毒載體，為后續(xù)觀察沉默膜聯(lián)蛋白A1對兔骨髓間充質(zhì)干細胞和成骨細胞生物特性的影

3、響，以及進一步探討激素性股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機制奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法:針對兔膜聯(lián)蛋白A1基因設(shè)計RNA干擾靶序列，合成Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與BamHI和EcoRI雙酶切后的pGLV/H1/GFP載體連接成pGLV-shANXA1，PCR篩選陽性克隆，測序鑒定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共轉(zhuǎn)染293 FT細胞包裝產(chǎn)生慢病毒載體

4、LV-shANXA1，并根據(jù)GFP的表達測定慢病毒的滴度。
　　結(jié)果:經(jīng)PCR和測序證實構(gòu)建片段大小及DNA序列與目標(biāo)序列一致，shANXA1片段完全正確插入慢病毒載體pGLV/H1/GFP中。包裝濃縮慢病毒顆粒LV-shANXA1-764、LV-shANXA1-844、LV-shANXA1-901、LV-shANXA1-NC的滴度分別為3.7×108TU/L、4.1×108TU/L、3.6×108TU/L、3.7×108TU/L

5、。
　　結(jié)論:實驗成功構(gòu)建的兔膜聯(lián)蛋白A1基因短發(fā)夾RNA慢病毒載體。
　　第二部分沉默膜聯(lián)蛋白A1基因表達對兔骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及成骨分化能力的影響
　　目的:觀察沉默膜聯(lián)蛋白A1基因?qū)ν霉撬栝g充質(zhì)干細胞增殖及成骨分化能力的影響。
　　方法:取新西蘭大白兔的全骨髓細胞進行體外培養(yǎng)和純化，采用流式細胞術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細胞的純度。用不同感染復(fù)數(shù)(MOI)值的慢病毒載體LV-shANXA1-NC感染骨髓間充質(zhì)干細

6、胞后測定細胞的感染效率，并篩選最佳的感染復(fù)數(shù)值。分別用慢病毒載體LV-shANXA1-764、LV-shANXA1-844、LV-shANXA1-901感染骨髓間充質(zhì)干細胞下調(diào)ANXA1基因的表達，采用Real time PCR和Western blot檢測慢病毒載體對ANXA1基因的沉默效率，并篩選最高沉默效率的慢病毒載體。
　　將體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞分三組:RNA干擾組用慢病毒載體LV-shANXA1-901感染骨髓間充

7、質(zhì)干細胞下調(diào)膜聯(lián)蛋白A1基因的表達;陰性對照組用攜帶無義基因序列的慢病毒載體LV-shANXA1-NC感染骨髓間充質(zhì)干細胞;空白對照組不加任何干預(yù)措施。采用MTT法評估各組骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖能力;采用堿性磷酸酶染色、礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色和堿性磷酸酶活性的測定評估各組骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化能力。
　　結(jié)果:純化后的骨髓間充質(zhì)干細胞CD44、CD105表達陽性率分別為97.2％和95.8％，而CD45陽性率為2.5％。LV-sh

8、ANXA1對骨髓間充質(zhì)干細胞的最佳感染復(fù)數(shù)的值為50。感染復(fù)數(shù)為50時，LV-shANXA1對骨髓間充質(zhì)干細胞感染效率為（91.4±2.7）％。實時PCR和Western blot檢測顯示，LV-shANXA1-901對膜聯(lián)蛋白A1基因的沉默效率最高，在感染復(fù)數(shù)為50時，沉默效率可達70％以上。膜聯(lián)蛋白A1表達下調(diào)后，骨髓間充質(zhì)干細胞出現(xiàn)明顯生長抑制（P＜0.05），在隨后成骨分化誘導(dǎo)后，細胞的堿性磷酸酶染色陽性率和堿性磷酸酶活性明顯降

9、低(P＜0.05），且茜素紅染色呈陰性反應(yīng)。
　　結(jié)論:慢病毒載體LV-shANXA1-901能有效沉默膜聯(lián)蛋白A1基因在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達;沉默膜聯(lián)蛋白A1基因降低骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及成骨分化能力。
　　第三部分沉默膜聯(lián)蛋白A1基因表達對兔成骨細胞凋亡的影響
　　目的:觀察沉默膜聯(lián)蛋白A1基因?qū)ν贸晒羌毎蛲龅挠绊憽?br>　　方法:將體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化成成骨細胞。用不同感染復(fù)數(shù)(MOI)值的

10、慢病毒載體LV-shANXA1-NC感染成骨細胞后測定細胞的感染效率，并篩選最佳的感染復(fù)數(shù)值。按最佳感染復(fù)數(shù)值的慢病毒載體LV-shANXA1-901感染成骨細胞下調(diào)ANXA1基因的表達，采用Real timePCR和Western blot檢測慢病毒載體對ANXA1基因的沉默效率。
　　將骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)分化成成骨細胞后分三組:RNA干擾組用攜帶針對膜聯(lián)蛋白A1基因的短發(fā)夾RNA慢病毒載體LV-shANXA1感染成骨細胞

11、下調(diào)膜聯(lián)蛋白A1基因的表達;陰性對照組用攜帶無義基因序列的慢病毒載體LV-shANXA1-NC感染陳骨細胞;空白對照組不加任何干預(yù)措施。采用半胱天冬酶3活性測定、流式細胞術(shù)及Tunel法評估ANXA1基因表達下調(diào)對成骨細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)成骨分化誘導(dǎo)14 d后，細胞的堿性磷酸酶染色陽性率為（95.0±3.6）％，茜素紅染色呈強陽性反應(yīng)。LV-shANXA1對成骨細胞的最佳感染復(fù)數(shù)的值為50。在感染復(fù)數(shù)為5

12、0時，LV-shANXA1對成骨細胞感染效率為（92.6±3.7）％。Real-time PCR和Western blot檢測顯示感染復(fù)數(shù)為50時，LV-shANXA1對成骨細胞ANXA1基因的沉默效率效率可達70％以上。ANXA1表達下調(diào)后，成骨細胞半胱天冬酶3活性升高，經(jīng)流式細胞術(shù)和Tunel法檢測細胞的凋亡率增加，均高于空白對照和陰性對照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:慢病毒載體LV-shANXA1-901能有效沉默膜聯(lián)蛋白