丹參對體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、目的: 探討丹參對體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells.MSCs)的增殖及向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。將中藥研究與細(xì)胞工程相結(jié)合，推動中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程，開拓中藥與細(xì)胞工程研究，有重要的學(xué)術(shù)價值、實用價值與社會意義。 方法: 1.建立hMSCs體外分離、培養(yǎng)和鑒定的方法體系。用Percoll梯度分離液離心分離單個核細(xì)胞后，置于37℃、5％CO2、飽和濕度孵箱培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增。

2、3代以后的細(xì)胞用于實驗。其中：實驗組細(xì)胞用10ug/ml丹參素培養(yǎng)液培養(yǎng)，對照組用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)。以上二組培養(yǎng)條件同前，換液，傳代方法同前。倒置顯微鏡觀察；測定其生長增殖曲線；酶聯(lián)免疫法行細(xì)胞表面抗原檢測。鑒定從骨髓中分離培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.定向誘導(dǎo)hMSCs向成骨細(xì)胞分化。 取生長狀態(tài)的良好的第三代 hMSCs，調(diào)整其濃度為105/ml左右，每取0.5ml接種于12孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60％-70％融合

3、時，棄培養(yǎng)液，實驗分成三個平行組(A、B、C)，A組空白組：不加任何誘導(dǎo)濟(jì)；B對照組：誘導(dǎo)液(普通培養(yǎng)液加100nmol/Dex，10mmol/Lβ—GP，50umol/LAA)進(jìn)行培養(yǎng)：C組：實驗組：誘導(dǎo)液+10ug/ml丹參素培養(yǎng)液，作用24小時后，B組換成新鮮培養(yǎng)液，C組換成10ug/ml丹參素培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。視培養(yǎng)基顏色變化，每隔2—3天更換培養(yǎng)液。倒置顯微鏡逐日觀察細(xì)胞生長增殖及形態(tài)變化情況，行堿性磷酸酶染色和Yon—Eoss

4、a法鈣結(jié)節(jié)染色。 結(jié)果: 密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法能有效分離提純hMSCs，體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞在48h內(nèi)有少量細(xì)胞貼壁，隨后形成紡錐狀成纖維細(xì)胞樣集落單位，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致；細(xì)胞生長增殖活躍；CD29和CD71表達(dá)陽性，CD34表達(dá)陰性。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第7天實驗組堿性磷酸酶染色陽性，第7天Von-Kossa法鈣結(jié)節(jié)染色陽性。對照組細(xì)胞堿性磷酸酶染色大部分為陰性，少數(shù)為弱陽性。Yon--Kossa法