RNAi沉默多發(fā)性骨髓瘤DKK1基因對成骨細胞分化的影響.pdf

1、目的：
　　 通過實驗證實多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266表達DKK1,其上清液能夠抑制鼠成骨祖細胞MC3T3E1的成骨分化過程,并通過RNAi致DKK1基因沉默,DKK1表達下降,從而減輕對小鼠成骨祖細胞MC3T3-E1成骨分化的抑制,初步探討DKK1在骨髓瘤骨病(MBD)發(fā)病中的作用。
　　 方法：
　　 1.RT-PCR方法測定多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266在mRNA水平上是否表達DKK1,采用Western blo

2、t方法檢測多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266上清液中是否存在可溶性的DKK1。
　　 2.將重組質粒pLenti6/V5-Gw/DKK-1-miR,與慢病毒包裝質粒一起經脂質體2000轉染293FT細胞,48h后收獲細胞上清液獲得慢病毒,高速離心濃縮后感染骨髓瘤細胞株U266,經Blasticidin篩選后得到DKK1基因長期沉默的U266細胞株,RT-PCR檢測胞漿DKK1 mRNA表達和Western blot法檢測濃縮50倍的細胞

3、上清液中DKK1蛋白的表達來分析DKK1 RNAi的效率。
　　 3.將U266原細胞株、DKK1 RNAi U266細胞株和無關序列RNAi的U266細胞株等3種細胞培養(yǎng)上清液以30％濃度的量分別加入BMP-2誘導MC3T3-E1成骨祖細胞分化體系中,12天后觀察3者對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響,觀察指標為MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)和核心結合因子1(Cbfa-1)的mRNA水平,堿性磷酸酶

4、(ALP)染色結節(jié)計數和鈣結節(jié)計數。
　　 結果：
　　 1.慢病毒高速離心濃縮15倍后感染NIH3T3細胞,48h表達增強型綠色熒光蛋白(EmGFP),流式細胞術檢測NIH3T3細胞EmGFP表達率計算出慢病毒濃縮液滴度為4.27×105TU/ml；
　　 2.采用半定量RT-PCR法可檢測到骨髓瘤細胞株U266表達較高的DKK1 mRNA,并且在骨髓瘤細胞株U266上清液中以Western blot法可檢測到

5、可溶性DKK1蛋白。結果證實在U266細胞株中存在DKK-1的表達。
　　 3.我們觀察加入30％U266上清至鼠成骨誘導體系中12天后,觀察到成骨分化明顯抑制,ALP、Cbfa-1、OCmRNA表達,鈣結節(jié)計數,ALP結節(jié)計數明顯降低。(ALP結節(jié)及鈣結節(jié)計數及P<0.001,mRNA均P<0.05)。
　　 4.與普通U266細胞比較,DKK1 RNAi U266細胞的DKK1表達量有明顯減少(P<0.001),抑制

6、率達50％以上。且經過多次凍存、傳代后,再次檢測相關指標發(fā)現DKK1仍被穩(wěn)定抑制。
　　 5.我們看到30％DKK1 RNAi U266上清干預組與30％U266上清干預組比較,ALP、Cbfa-1、OC表達,鈣結節(jié)計數,ALP結節(jié)計數明顯升高(ALP結節(jié)和mRNA P<0.05,鈣結節(jié)計數P<0.01),而與誘導組比較,ALP、Cbfa-1、OC表達,鈣結節(jié)計數,ALP結節(jié)計數變化不明顯(P>0.05)。30％無關序列shRN

7、A U266上清干預組與30％U266上清干預組比較,ALP、Cbfa-1、OC表達,鈣結節(jié)計數,ALP結節(jié)計數無明顯差別(P>0.05),30％無關序列shRNA U266上清干預組與30％DKK1 shRNA U266上清干預組比較,ALP、Cbfa-1、OC表達,鈣結節(jié)計數,ALP結節(jié)計數有所降低(ALP、OC,P<0.01；Cbfa-1,P<0.05,ALP結節(jié)計數P<0.001,鈣結節(jié)計數P<0.001)。
　　 結論