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文檔簡介
1、第一部分,多發(fā)性骨髓瘤側群細胞分選及生物學特性的體外鑒定
[目的]:鑒定多發(fā)性骨髓瘤側群細胞的存在及生物學特性
[方法]:應用流式細胞儀分選七例多發(fā)性骨髓瘤患者原代標本及五個MM細胞株的SP細胞。通過細胞周期、免疫表型、集落形成實驗、ABCG2mRNA表達量等對SP進行生物學特性的鑒定。并在不同MM治療藥物(A、硼替佐米、As203)作用下,分別使用MTT和集落形成實驗檢測對骨髓瘤SP增殖、活力和集落形成能力
2、的影響。
[結果]:本研究檢測了5種MM細胞株,發(fā)現(xiàn)SP細胞含量波動于0.8256-1.762%,并在7例MM患者骨髓標本中檢測到SP細胞占0.04-2.0%。與MP相比,SP細胞多處于G0/G1期(95.47%VS49.36%,P<0.05),較少的細胞處于S期(3.27%VS40.84%,P<0.05)。在免疫表型研究中,觀察到SP和MP的CD138、CD38表達并無顯著差異,分別為(78.5±8.5)%VS(82.0
3、±4.0)%和(72.3±15.7)%VS(84.3±11.9)%,P>0.05。MM細胞株NCI-H929的SP細胞的集落形成數(shù)明顯高于MP細胞(1392±257VS550±15,P=0.08)。Realtime-PCR顯示SP細胞ABCG2的表達明顯高于MP細胞(P<0.05)。MTT顯示在藥物相同的作用濃度下,NCI-H929、RPMI8226的細胞生長抑制率隨時間的延長逐漸增加?;衔顰(4μM、8μM)、硼替佐米(10nM、2
4、5nM)及三氧化二砷(1.25μM、2.5μM)分別對NCI-H929及RPMI8226作用24H后,流式細胞儀檢測SP細胞的比例變化,發(fā)現(xiàn)藥物A能夠特異性的殺傷SP細胞,而對其他細胞作用不明顯,硼替佐米及三氧化二砷非特異性殺傷整體細胞,對SP細胞沒有特異性的殺傷作用;而來那度胺(200μM、400μM)作用MM細胞株NCI-H929及RPMI822624H后,能特異性的減少SP細胞比例。分別用化合物A(8μM)和硼替佐米(10nM)作
5、用MM細胞株NCH-H929的SP、MP細胞,發(fā)現(xiàn)均能降低SP、MP的集落形成,化合物A分別作用于SP、MP,集落形成數(shù)目分別為354±9、287±84,硼替佐米分別作用于SP、MP,集落形成數(shù)目分別為80±23、36±41。
[結論]:MM細胞株及原代患者均存在SP細胞,MM細胞株的SP細胞在細胞周期、集落形成能力及ABCG2表達量上與MP均存在顯著性差異,而SP和MP在CD38和CD138的表達上無顯著性差異。不同濃度
6、的化合物A、硼替佐米、三氧化二砷對MM細胞株NCI-H929、RPMI8226均有抑制作用,并且在一定濃度范圍內呈時間和劑量依賴性。藥物A能夠特異性的殺傷SP細胞,而對其他細胞作用不明顯,硼替佐米及三氧化二砷非特異性殺傷整體細胞,對SP細胞沒有特異性的殺傷作用。來那度胺對MM細胞株NCI-H929及RPMI8226的SP細胞作用不明顯?;衔顰和硼替佐米均能降低MM細胞株NCI-H929SP、MP的集落形成。
第二部分,多
7、發(fā)性骨髓瘤側群miRNA表達譜鑒定及相關研究
[目的]:篩選骨髓瘤SP細胞相關miRNA表達譜,生物信息學分析預測靶基因及信號通路,進而證明某些特異性的miRNA表達變化可能影響靶基因表達變化的新機制,從而為改善骨髓瘤治療開拓新的領域。
[方法]:miRNA芯片技術篩選MMSP細胞和MP細胞的miRNA表達譜。流式細胞儀分選MM細胞株NCI-H929、RPMI8226和LP-1及3例MM患者的SP細胞及MP細
8、胞,tealtime-PCR技術驗證芯片結果。生物信息學技術分析MMSP細胞相關通路及靶基因,Werternblotting檢測MMSP和MP細胞在MAPKs信號傳導通路上Erk1/2表達量的區(qū)別。
[結果]:分別使用兩種芯片平臺,檢測了兩對多發(fā)性骨髓瘤原代標本及RPMI8226骨髓瘤細胞的SP和MP細胞,存在于骨髓瘤SP細胞相關特異miRNA表達譜,包括10個miRNAs在MM的SP細胞中表達顯著上調,33個miRNAs
9、在MM的SP細胞中表達顯著下調;而后采用real-timePCR技術細胞驗證芯片結果(miR-144,miR-451,miR-150),發(fā)現(xiàn)同芯片結果相同,SP于MP對比,miR-144和miR-451顯著上調,miR-150顯著下調。經(jīng)過生物信息學分析,具有統(tǒng)計學意義的有30個通路(P<0.01)。結合文獻報道,其中與腫瘤干細胞及MM發(fā)病相關的通路包括:Pathwaysincancer,F(xiàn)ocaladhesion,Endocytosi
10、s,MAPKsignalingpathway,ErbBsignalingpathway,Wntsignalingpathway,mTORsignalingpathway,Ubiquitinmediatedproteolysis,TGF-betasignalingpathway。Westernblotting技術發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)SP的p-Erk1/2、p-S6、p-S6K1、p-Src表達量明顯下調,TSC1表達無明顯變化。免疫熒光技術證實了SP
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