敲低Dnmt1和Dnmt3b對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞凋亡、周期和基因組DNA甲基化水平的影響.pdf

1、供體細(xì)胞不完全重編程被認(rèn)為是體細(xì)胞核移植效率低下的主要原因，甲基轉(zhuǎn)移酶1（Dnmt1）和甲基轉(zhuǎn)移酶3b（Dnmt3b）在早期胚胎發(fā)育中的正確表達(dá)對(duì)胚胎后期發(fā)育有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)這兩種酶在胚胎附植前表達(dá)較少，而體細(xì)胞核移植胚胎中表達(dá)比體內(nèi)正常胚胎高。在癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，同時(shí)干擾兩者更能降低基因組甲基化水平，而在體細(xì)胞中同時(shí)干擾Dnmt1、Dnmt3b會(huì)給細(xì)胞帶來何影響還未見報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)為實(shí)驗(yàn)

2、對(duì)象，用RNA干擾（RNAi）方法對(duì)MEF Dnmt1和Dnmt3b進(jìn)行干擾，研究分別干擾和同時(shí)干擾這兩個(gè)基因?qū)?xì)胞凋亡、周期、甲基化水平的影響。實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為Dnmt1干擾組(80nM)、Dnmt3b干擾組(80nM)、NC-Dnmt1/Dnmt3b組(80nM)、Dnmt1+Dnmt3b干擾組(80+80nM)、NC-Dnmt1+Dnmt3b(80+80nM)及空白對(duì)照組;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)檢測(cè)Dnmt1、Dnmt3b

3、和PCNA(proliferatingcell nuclear antigen，增殖細(xì)胞核抗原)mRNA表達(dá);蛋白免疫印記(Western Blot)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組DNMT1、DNMT3b蛋白變化情況;用凋亡、周期試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡、周期情況;DNA甲基化定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞基因組DNA總體甲基化水平。主要結(jié)果如下:
　　1.干擾后24h，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行q-PCR檢測(cè)mRNA水平發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組(NC)比較，單獨(dú)干擾D

4、nmt1使其mRNA下降69.6％，單獨(dú)干擾Dnmt3b使其mRNA水平下降63.1％;與同時(shí)干擾組的NC相比，同時(shí)干擾組Dnmt1 mRNA下降60.1％，Dnmt3b mRNA下降63.4％; Dnmt1干擾顯著降低了單獨(dú)干擾組DNMT1蛋白約48％(P＜0.01)，干擾Dnmt3b也使其同時(shí)干擾組蛋白表達(dá)下降20％（P＜0.01）;
　　2.干擾后24h，Dnmt3b干擾組PCNA mRNA水平顯著降低(P＜0.05），同時(shí)

5、干擾組PCNA mRNA下降極顯著（P＜0.01）。推測(cè)干擾Dnmt3b以及同時(shí)干擾Dnmt1和Dnmt3b抑制了MEFs細(xì)胞增殖;
　　3.干擾后48h用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，與NC組相比，干擾Dnmt3b顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（P＜0.05），同時(shí)干擾組顯著誘導(dǎo)中晚期凋亡和總凋亡（P＜0.01）;同時(shí)干擾組p53蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）;
　　4.檢測(cè)siRNA干擾后48h對(duì)MEFs細(xì)胞周期影響發(fā)現(xiàn)，同時(shí)干擾組處