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文檔簡介
1、供體細胞不完全重編程被認為是體細胞核移植效率低下的主要原因,甲基轉(zhuǎn)移酶1(Dnmt1)和甲基轉(zhuǎn)移酶3b(Dnmt3b)在早期胚胎發(fā)育中的正確表達對胚胎后期發(fā)育有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)這兩種酶在胚胎附植前表達較少,而體細胞核移植胚胎中表達比體內(nèi)正常胚胎高。在癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn),同時干擾兩者更能降低基因組甲基化水平,而在體細胞中同時干擾Dnmt1、Dnmt3b會給細胞帶來何影響還未見報道。
本實驗以小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)為實驗
2、對象,用RNA干擾(RNAi)方法對MEF Dnmt1和Dnmt3b進行干擾,研究分別干擾和同時干擾這兩個基因?qū)毎蛲觥⒅芷?、甲基化水平的影響。實驗組隨機分為Dnmt1干擾組(80nM)、Dnmt3b干擾組(80nM)、NC-Dnmt1/Dnmt3b組(80nM)、Dnmt1+Dnmt3b干擾組(80+80nM)、NC-Dnmt1+Dnmt3b(80+80nM)及空白對照組;實時熒光定量PCR(q-PCR)檢測Dnmt1、Dnmt3b
3、和PCNA(proliferatingcell nuclear antigen,增殖細胞核抗原)mRNA表達;蛋白免疫印記(Western Blot)檢測各實驗組DNMT1、DNMT3b蛋白變化情況;用凋亡、周期試劑盒分別檢測細胞凋亡、周期情況;DNA甲基化定量檢測試劑盒檢測細胞基因組DNA總體甲基化水平。主要結(jié)果如下:
1.干擾后24h,提取細胞總RNA進行q-PCR檢測mRNA水平發(fā)現(xiàn),與陰性對照組(NC)比較,單獨干擾D
4、nmt1使其mRNA下降69.6%,單獨干擾Dnmt3b使其mRNA水平下降63.1%;與同時干擾組的NC相比,同時干擾組Dnmt1 mRNA下降60.1%,Dnmt3b mRNA下降63.4%; Dnmt1干擾顯著降低了單獨干擾組DNMT1蛋白約48%(P<0.01),干擾Dnmt3b也使其同時干擾組蛋白表達下降20%(P<0.01);
2.干擾后24h,Dnmt3b干擾組PCNA mRNA水平顯著降低(P<0.05),同時
5、干擾組PCNA mRNA下降極顯著(P<0.01)。推測干擾Dnmt3b以及同時干擾Dnmt1和Dnmt3b抑制了MEFs細胞增殖;
3.干擾后48h用流式細胞儀檢測細胞凋亡變化,與NC組相比,干擾Dnmt3b顯著誘導(dǎo)細胞凋亡(P<0.05),同時干擾組顯著誘導(dǎo)中晚期凋亡和總凋亡(P<0.01);同時干擾組p53蛋白表達顯著升高(P<0.05);
4.檢測siRNA干擾后48h對MEFs細胞周期影響發(fā)現(xiàn),同時干擾組處
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