RG108對水牛成纖維細胞甲基化水平及核移植胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、體細胞核移植技術在多年的研究發(fā)展中日益完善，但核移植效率仍然較低，限制了體細胞核移植技術的應用。目前普遍認為，核移植效率低主要是由于供體細胞核在卵母細胞中的去分化和重編程不完全。體細胞核移植重構胚常常表現(xiàn)為DNA甲基化水平過高。本研究擬通過探討新型DNA甲基轉移酶抑制劑RG108對水牛成纖維細胞甲基化水平及其核移植重構胚發(fā)育的影響，探索一種能提高核移植效率的有效途徑。
　　 首先，探討了不同濃度DNA甲基轉移酶抑制劑RG108對

2、水牛成纖維細胞生長特性、染色體倍性、DNA甲基化水平及DNMTs mRNA表達量的影響。第7代水牛成纖維細胞經不同濃度RG108(0，5，10，20，100μmol/L)處理72h后，分別對細胞的生長狀態(tài)、染色體倍性及甲基化水平等進行檢測分析。結果顯示：(1)經臺盼藍染色結合細胞計數(shù)法檢測細胞存活率并繪制細胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)經不同濃度RG108處理的水牛成纖維細胞生長曲線與對照組(0μmol/L)基本一致，各組間細胞的存活率沒有顯著下降現(xiàn)

3、象(P>0.05)；(2)細胞常規(guī)染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度組(0、5、10、20、100μmol/L)的細胞染色體非整二倍體百分比(10.3％、12.3％、10.3％、12.1％、12.6％)之間差異均不顯著(P>0.05)；(3)免疫熒光組化間接檢測水牛成纖維細胞5-甲基胞嘧啶的相對含量發(fā)現(xiàn)，隨著RG108處理濃度的升高，水牛成纖維細胞的熒光相對強度逐漸降低，其中添加20、100μmol/LRG108的兩個處理組與對照組差異顯著(

4、P<0.05)，但兩個處理組(20、100μmol/L)之間差異不顯著(P>0.05)；(4)實時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測結果顯示，濃度為10、20、100μmol/L的RG108都顯著下調細胞DNMT1mRNA的表達(P<0.05)，并以20μmol/L組最顯著，但RG108對DNMT3amRNA的表達沒有顯著性影響(P>0.05)。
　　 同時，探討了RG108處理水牛成纖維供體細胞對水牛體細胞核移植重構胚發(fā)育的影響

5、。使用20μmol/L RG108分別處理水牛成纖維供體細胞不同時間(0、24、48、72、96 h)后進行體細胞核移植。結果發(fā)現(xiàn)，20μmol/LRG108處理供體細胞72 h可顯著提高核移植重構胚的囊胚發(fā)育率(P<0.05)，而且其囊胚細胞數(shù)與IVF組的囊胚細胞數(shù)差異不顯著(P>0.05)。
　　 以上結果表明：(1)適宜濃度(≤100μmol/L)的RG108對水牛成纖維細胞的生長特性、存活率及核型沒有顯著影響；(2)濃度