水牛供體細(xì)胞組蛋白乙?；c核移植胚胎發(fā)育能力相關(guān)性的研究.pdf

1、本研究主要探討供體細(xì)胞的組蛋白乙?；綄?duì)水牛核移植效果的影響，并對(duì)核移植胚胎、體外受精(IVF)胚胎、孤雌激活(PA)胚胎的組蛋白乙酰化水平進(jìn)行初步分析，探討組蛋白乙酰化水平與胚胎發(fā)育能力的相關(guān)性。 以水牛成纖維細(xì)胞為材料，建立了使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)mRNA表達(dá)的方法。以牛mRNA序列作為參考序列設(shè)計(jì)的引物可成功克隆水牛組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶1(HAT1)，去乙?；?(HDAC1)和組蛋白H2A基因片段，測(cè)序結(jié)果表明所

2、得cDNA序列與牛同源性在98％以上；三對(duì)引物的反應(yīng)性完全滿(mǎn)足實(shí)時(shí)熒光定量PCR的要求；兩個(gè)目的基因HAT1、HDAC1擴(kuò)增效率(98.2％，97.5％)與參照基因H2A(106％)接近；當(dāng)反應(yīng)體系中，cDNA模板量為0.5μL(相當(dāng)于總RNA 50ng)，濃度為lμM的引物0.5μL時(shí)，能高效獲得特異性強(qiáng)的目的產(chǎn)物。 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)用去乙?；敢种苿㏕ichostatin A(TSA)處理的供體細(xì)胞的HATl、HD

3、ACl．mRNA變化情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩種基因mRNA水平隨TSA的處理時(shí)間、濃度不同發(fā)生相應(yīng)的變化。0.15μM TSA處理72h可顯著提高HAT1的mRNA水平(P<0.05)，rSA處理48h時(shí)可顯著降低HDACl的mRNA水平(P<0.05)。 探討了TSA處理供體細(xì)胞對(duì)其核移植效果的影響。結(jié)果顯示，隨著TSA處理濃度升高，核移植胚胎的卵裂率、囊胚率逐漸升高；當(dāng)以0.15μM TSA處理72h、0.3μM TSA

4、處理48h、0.6μM TSA處理24h的細(xì)胞作為供體時(shí)，可以顯著提高核移植胚胎的發(fā)育率(P<0.05，囊胚率分別為：30％、30.8％、30.3％vs 19％)。對(duì)不同來(lái)源胚胎組蛋白第8位賴(lài)氨酸殘基乙?；降牟町愡M(jìn)行了初步的分析。不同來(lái)源胚胎組蛋白乙酰化水平在不同階段均發(fā)生動(dòng)態(tài)變化：供體經(jīng)TSA處理過(guò)的核移植胚胎組蛋白乙?；匠?-細(xì)胞期低于PA胚胎、8-細(xì)胞期低手IVF胚胎外，其余各發(fā)育階段均高于供體未作處理的核移植胚胎、IVF

5、胚胎和PA胚胎；供體未作處理的核移植胚胎組蛋白乙?；皆?-細(xì)胞期出現(xiàn)短暫的升高后又下降，隨后變化模式與TSA處理組相似；IVF胚胎的組蛋白乙酰化水平則是持續(xù)升高，在囊胚期達(dá)到最高；PA胚胎的組蛋白乙酰化水平除4、8-細(xì)胞期較低外，其余發(fā)育階段相對(duì)穩(wěn)定。 以上結(jié)果表明：(1)參照已經(jīng)公布的牛mRNA序列可以設(shè)計(jì)出用于水牛H2A，HAT1，HDAC1基因分析的實(shí)時(shí)定量PCR引物；(2)適宜的引物、高質(zhì)量的cDNA以及合適的PCR