組蛋白去乙酰化酶參與斑馬魚后部側(cè)線系統(tǒng)的早期發(fā)育以及內(nèi)耳前體細胞的分化過程.pdf

1、內(nèi)耳毛細胞的損傷丟失所導(dǎo)致的耳聾是感音神經(jīng)性聾的主要原因。哺乳類動物內(nèi)耳毛細胞受損后不具備自我修復(fù)和再生能力，故由毛細胞變性壞死所引發(fā)的耳聾是不可治愈的。但在某些魚類和兩棲類動物中的毛細胞損傷丟失后可以繼續(xù)增殖，從而自發(fā)生成新的毛細胞，可用于毛細胞再生的研究。斑馬魚因與人類有很高的同源性，發(fā)育周期短等優(yōu)點備受關(guān)注。因胚胎身體透明，方便構(gòu)建各種熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，用于活細胞成像觀察(live imaging)這些基因的表達模式。斑馬魚

2、側(cè)線器毛細胞在結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳類動物內(nèi)耳毛細胞類似，且因側(cè)線器位于體表，使得毛細胞易于被觀察檢測。上述優(yōu)勢使得斑馬魚成為研究毛細胞發(fā)育及再生的較為理想的模式生物。
　　側(cè)線系統(tǒng)(lateral line system，LL)作為魚類和兩棲類特有的感覺器官，具有感知水流、水壓和聽覺等功能。它由多個位于體表的神經(jīng)丘(neuromast)細胞為單位組成。側(cè)線系統(tǒng)根據(jù)分布排列的位置分為前部側(cè)線系統(tǒng)(Anterior laterallin

3、e system，ALL)和后部側(cè)線系統(tǒng)(Posterior lateral line system，PLL)，前者包括頭部的神經(jīng)丘細胞，后者包括軀干和尾部的神經(jīng)丘細胞。側(cè)線神經(jīng)丘細胞的基本結(jié)構(gòu)單位是由位于神經(jīng)丘中央的毛細胞(Hair Cell,HC)以及位于周邊的支持細胞(Supporting Cell，SC)所構(gòu)成。近年來國內(nèi)外學(xué)者對側(cè)線系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能及器官發(fā)育等方面均展開了廣泛系統(tǒng)的研究。
　　組蛋白的乙?；?去乙?；揎検?/p>

4、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要機制之一，在細胞增殖、分化、凋亡以及細胞周期等生物過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。組蛋白的乙酰化主要與基因轉(zhuǎn)錄的激活相關(guān)，組蛋白的去乙?；瘎t主要與基因沉默有關(guān)。組蛋白的乙?；揎検怯山M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)與組蛋白去乙酰化轉(zhuǎn)移酶(histone deacetylases，HDACs)的動態(tài)平衡來維持的。組蛋白乙?；?去乙?；揎椩谂咛グl(fā)育、多種器官和系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)生

5、等生物學(xué)過程中起著重要作用。近年的研究表明組蛋白去乙酰化修飾與神經(jīng)干細胞的分化關(guān)系密切，組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶影響神經(jīng)前體細胞的分化方向。但關(guān)于乙?；?去乙酰化修飾在聽覺系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育等一系列生理學(xué)以及病理學(xué)過程中的作用的研究并不多見。
　　有研究表明組蛋白去乙?；揎椗c內(nèi)耳感覺上皮支持細胞的分裂增殖有密切關(guān)系。組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑對雞橢圓囊感覺上皮支持細胞的再生性增殖有抑制作用。然而組蛋白去乙?；揎椩诎唏R魚側(cè)線器早期發(fā)育以

6、及神經(jīng)丘毛細胞分化過程中發(fā)揮何種作用目前尚不清楚。我們首先以斑馬魚為模型觀察組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑對斑馬魚后部側(cè)線系統(tǒng)發(fā)育的影響。重點研究HDACs在斑馬魚側(cè)線原基的遷徙，神經(jīng)丘的沉積以及側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞的分化這三個過程中的作用，為今后研究魚類后部側(cè)線系統(tǒng)發(fā)育的分子機制提供了一種新的結(jié)合點。最后我們觀察HDACs對哺乳動物內(nèi)耳前體細胞定向分化的影響，將組蛋白修飾與內(nèi)耳前體細胞定向分化聯(lián)系起來，為治療感音神經(jīng)性聾提供了一種新的思路。<

7、br>　　第一部分組蛋白去乙?；竻⑴c斑馬魚后部側(cè)線原基遷徙以及神經(jīng)丘沉積過程
　　目的:
　　研究組蛋白去乙?；笇Π唏R魚后部側(cè)線原基(posterior lateral lineprimordium)遷徙以及神經(jīng)丘沉積的影響。
　　材料與方法:
　　選擇6hpf的斑馬魚胚胎，分別用不同濃度的組蛋白去乙?；敢种苿┍焖猁}(VPA)、曲古菌素A(TSA)處理胚胎，用DAPI對細胞核進行染色，在熒光顯微鏡下觀察斑

8、馬魚后部側(cè)線原基的遷徙以及神經(jīng)丘的沉積情況。合成地高辛標(biāo)記的cxcr7b反義RNA探針，進行斑馬魚全標(biāo)本包埋的RNA原位雜交，研究cxcr7b mRNA在原基遷移過程中的表達情況。BrdU標(biāo)記增殖細胞，觀察原基細胞團的增殖情況。使用蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)方法檢測斑馬魚整體胚胎組蛋白H3和H4的乙酰化水平。
　　結(jié)果:
　　1.VPA的處理對斑馬魚胚胎的形態(tài)、存活率、孵出率以及行為學(xué)等方面均有影響。表現(xiàn)為隨著藥

9、物濃度增加，身體畸形率增高、胚胎的孵出率和存活率均下降，高濃度VPA(200μM)處理6hpf胚胎持續(xù)至3dpf時，死亡率高達20％，藥物持續(xù)處理至5dpf時，胚胎基本全部死亡。VPA處理組亦有明顯的行為學(xué)改變，表現(xiàn)為以頭部為軸的風(fēng)車式轉(zhuǎn)動以及異常的逃脫反應(yīng)。蛋白質(zhì)印跡檢測表明VPA處理組的AceH3和AceH4蛋白水平增高;
　　2.VPA和TSA處理6hpf斑馬魚胚胎，發(fā)現(xiàn)藥物干擾后部側(cè)線系統(tǒng)(PLL)的早期發(fā)育，表現(xiàn)為延緩原

10、基遷徙速度，且呈濃度依賴性。cxcr7b的原位雜交結(jié)果進一步證實了該作用;
　　3.VPA和TSA處理組的側(cè)線神經(jīng)丘的空間分布異常，表現(xiàn)為處理組較對照組神經(jīng)丘所沉積的肌節(jié)位置滯后，尤其是軀干部第一個側(cè)線神經(jīng)丘(L1)的沉積位置顯著延后，且與藥物濃度呈正相關(guān);
　　4.免疫熒光染色分析原基細胞的增殖情況，結(jié)果顯示VPA和TSA處理組的原基細胞團BrdU陽性細胞數(shù)目較對照組明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1.VPA的處理

11、對斑馬魚胚胎的形態(tài)，存活率、孵出率以及行為學(xué)等方面均有影響;
　　2.組蛋白去乙?；敢种苿┑奶幚硌泳彴唏R魚后部側(cè)線原基的遷徙速度;
　　3.組蛋白去乙?；敢种苿┑奶幚碛绊懓唏R魚后部側(cè)線神經(jīng)丘的沉積過程，改變其空間分布;
　　4.組蛋白去乙?；敢种苿┑奶幚韺υ毎麍F有增殖抑制作用。
　　第二部分組蛋白去乙?；竻⑴c斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞的早期發(fā)育
　　目的:
　　研究組蛋白去乙?；笇Π唏R魚后部

12、側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞的分化以及神經(jīng)丘細胞增殖的影響。
　　材料與方法:
　　選擇3dpf的AB品系以及Brm-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎，分別用不同濃度的VPA(50、100、150μM),TSA(0.05、0.1、0.2μM)以及MS-275(5、10、15μM)處理胚胎發(fā)育至5dpf或7dpf。以MyosinⅥ以及GFP標(biāo)記和辨別已分化的毛細胞，活細胞染料FM1-43FX標(biāo)記有功能的毛細胞，BrdU標(biāo)記增殖細胞，TUNEL和cl

13、eaved caspase-3染色標(biāo)記凋亡細胞，在熒光顯微鏡以及激光共聚焦顯微鏡下觀察藥物處理對神經(jīng)丘細胞的增殖、凋亡及毛細胞分化情況的影響。使用免疫熒光染色和蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)方法檢測組蛋白去乙?；敢种苿Π唏R魚胚胎組蛋白H3、H4、H3K9、H3K14、H4K5和H4K12的乙?；降挠绊憽?br>　　結(jié)果:
　　1.組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑的處理致使神經(jīng)丘毛細胞數(shù)目減少，并呈劑量依賴性關(guān)系。同時使用

14、活細胞染料FM1-43FX標(biāo)記毛細胞，結(jié)果表明抑制劑的處理亦導(dǎo)致有功能的毛細胞數(shù)目減少。免疫熒光染色和Western Blot檢測的結(jié)果均顯示抑制劑處理組的組蛋白H3、H4、H3K9、H3K14、H4K5和H4K12的乙?；缴摺?br>　　2.BrdU標(biāo)計增殖細胞，結(jié)果顯示組蛋白去乙?；敢种苿┨幚斫M神經(jīng)丘細胞團中BrdU陽性細胞數(shù)目明顯減少。TSA（0.1μM）處理組神經(jīng)丘中BrdU陽性細胞數(shù)為8.2±0.3(n=35)，對照組

15、BrdU陽性細胞數(shù)為11.6±0.3(n=45)(P＜0.05)。VPA(100μM)處理組神經(jīng)丘中BrdU陽性細胞數(shù)為8.1±0.3(n=35)，對照組BrdU陽性細胞數(shù)為11.8±0.4(n=46)(P＜0.05)。MS-275(10μM)處理組神經(jīng)丘中BrdU陽性細胞數(shù)為6.8±0.3(n=32)，對照組BrdU陽性細胞數(shù)為11.6±0.3(n=45)(P＜0.05)。
　　3.高濃度或長時間的TSA處理可誘導(dǎo)神經(jīng)丘細胞凋亡

16、。神經(jīng)丘細胞可見TUNEL，cleaved caspase-3陽性染色。
　　結(jié)論:
　　1.組蛋白去乙酰化酶抑制劑對斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞的分化起抑制作用;
　　2.組蛋白去乙酰化酶抑制劑對斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘細胞有增殖抑制作用;
　　3.組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)神經(jīng)丘細胞凋亡呈劑量和時間依賴性。
　　第三部分組蛋白去乙?；竻⑴c新生小鼠內(nèi)耳前體細胞的分化
　　目的:
　　研究組蛋白去乙?；冈?/p>

17、新生小鼠耳蝸高增殖前體細胞向感覺上皮尤其是毛細胞方向分化過程中的作用。
　　材料與方法:
　　從新生(P0)ICR小鼠聽泡內(nèi)取得耳蝸基底膜組織，經(jīng)酶解消化后，用10％胎牛血清培養(yǎng)液中止消化。離心收集單細胞懸液，無血清培養(yǎng)液重懸細胞沉淀進行懸浮培養(yǎng)。至第8天時收集懸浮細胞球進行貼壁培養(yǎng)。實驗組給予TSA(0.1μM)處理，對照組給予DMSO處理，誘導(dǎo)分化1周后去除處理因素，繼續(xù)使用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)1周。收集第8天的懸浮細胞球和

18、貼壁培養(yǎng)14天的分化細胞，運用免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)檢測神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、溴脫氧尿嘧啶(BrdU)、Pax2，myosinⅦA和Sox2的表達;運用RT-PCR技術(shù)對內(nèi)耳發(fā)育相關(guān)基因進行分析。
　　結(jié)果:
　　內(nèi)耳前體細胞向毛細胞方向分化時，給予TSA處理，結(jié)果觀察到TSA處理組的myosinⅦA與Sox2陽性細胞數(shù)較對照組均明顯減少。同時檢測前體細胞的增殖能力，結(jié)果顯示TSA處理組的BrdU陽性細胞數(shù)明顯減少，且B