組蛋白乙?；揎棇?duì)小鼠核移植胚基因組重編程的調(diào)控.pdf

1、眾所周知，分化的體細(xì)胞核重編程為全能性狀態(tài)的效率非常低。盡管，已有大量試驗(yàn)證實(shí)核移植重構(gòu)胚能夠發(fā)育到囊胚期，但到足月階段的比例卻非常有限。對(duì)核重編程機(jī)制的進(jìn)一步理解，將有助于提高核移植效率。本研究以小鼠乳腺癌細(xì)胞為供體進(jìn)行核移植，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)，探索了體細(xì)胞核移植胚胎早期發(fā)育的基因表達(dá)模式；在此基礎(chǔ)上，對(duì)組蛋白乙?；隗w細(xì)胞克隆胚核重編程中的作用進(jìn)行深入研究。 1、小鼠乳腺癌細(xì)胞為供體的核移植重構(gòu)胚的發(fā)育本試驗(yàn)以小

2、鼠乳腺癌細(xì)胞為供體利用Piezo輔助進(jìn)行核移植，成功構(gòu)建了體細(xì)胞克隆胚胎。結(jié)果顯示，經(jīng)電擊融合，融合率達(dá)到76.3％(116/152)；化學(xué)激活(Sr<'2+>)后，90.5％(105/116)的重構(gòu)胚形成原核。體外繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，77.1％(81/105)的重構(gòu)胚發(fā)育到2-細(xì)胞；4-細(xì)胞和桑椹胚的發(fā)育率分別達(dá)到45.7％(48/105)和17.1％(18/105)。 2、發(fā)育相關(guān)基因在小鼠核移植胚基因組重編程中的表達(dá)研究為

3、了分析乳腺癌細(xì)胞核移植重構(gòu)胚的重編程能力，首先必須建立乳腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)模式。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)了ErbB2、Mucl、eIF-4C、MuERV-L和c-mos基因在小鼠乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。為了便于與核移植胚中上述基因表達(dá)的比較，選取50個(gè)乳腺癌細(xì)胞(與核移植胚數(shù)目相同)分析上述基因的表達(dá)狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ErbB2和Mucl基因在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，但未檢測(cè)到eIF-4C、MuERV-L和c-mOS基因的轉(zhuǎn)錄。運(yùn)用同

4、樣的方法檢測(cè)了乳腺癌細(xì)胞核移植胚中上述基因的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，eIF-4C和MuERV-L基因在克隆胚的1-細(xì)胞和2-細(xì)胞階段均有表達(dá)，且與IVF胚胎呈現(xiàn)相同的表達(dá)趨勢(shì)，即1-細(xì)胞階段低表達(dá)，2-細(xì)胞期瞬時(shí)高表達(dá)。然而在克隆胚中的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；值得一提的是，在IVF胚胎2-細(xì)胞階段無(wú)表達(dá)產(chǎn)物的c-mos基因，在克隆胚的2-細(xì)胞中被檢測(cè)到，推測(cè)可能是核移植胚中c-mos基因母源轉(zhuǎn)錄物未能得到有效降解亦或是核的重編程過(guò)

5、程導(dǎo)致c-mos重新轉(zhuǎn)錄。此外，在克隆胚和IVF胚中均未檢測(cè)到ErbB2和Mucl基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)證明核移植后的核質(zhì)相互作用抑制了分化細(xì)胞特有的基因表達(dá)，并建立了新的基因表達(dá)模式。 3、組蛋白乙?；谛∈蠛艘浦才呋蚪M重編程中的作用將小鼠乳腺癌細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞，構(gòu)建重組胚，在融合處理后立即加入TSA抑制卵細(xì)胞質(zhì)對(duì)供體核的去乙?；?，6h后洗去TsA，再用Sr<'2+>激活并培養(yǎng)到2．細(xì)胞階段。結(jié)果表明，激活前經(jīng)TSA處理

6、，eIF-4C、MuERV-L和c-mos基因在1-細(xì)胞和2-細(xì)胞胚胎中的表達(dá)水平均有所升高，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。采用aphidicolin抑制DNA復(fù)制，eIF-4C、MuERV-L和c-mos基因的表達(dá)水平也沒(méi)有顯著增加。此外，TSA處理的克隆胚在各個(gè)階段均未檢測(cè)到ErbB2和Mucl基因的表達(dá)。以上結(jié)果表明，抑制卵細(xì)胞質(zhì)對(duì)供體核的去乙?；茨苡绊懙缴鲜龌虻谋磉_(dá)模式。提示體細(xì)胞核中對(duì)胚胎發(fā)育重要基因的重編程

7、是獨(dú)立于卵子激活前的組蛋白乙酰化事件。 將TSA處理的時(shí)間從激活前處理6 h延長(zhǎng)至激活后的6 h(原核已形成)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，延長(zhǎng)處理后，eIF-4C、MuERV-L和c-mos基因的表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)；TsA和aphidicolin雙重處理組的基因表達(dá)水平與TSA單獨(dú)處理組差異不顯著(P>0.05)。在aphicicolin單獨(dú)處理組中基因的表達(dá)水平也沒(méi)有顯著升高，提示基因表達(dá)量的顯著增加是由于TSA誘導(dǎo)了核重編程過(guò)

8、程中組蛋白高度乙?；鸬?。此外，在TSA處理延長(zhǎng)至激活后6h，也沒(méi)有檢測(cè)到ErbB2和Mucl基因的轉(zhuǎn)錄。這表明組蛋白的乙?；揎椏赡軟](méi)有參與卵細(xì)胞質(zhì)對(duì)分化細(xì)胞特有的基因轉(zhuǎn)錄的抑制，但引起了基因表達(dá)模式的變化。 試驗(yàn)還進(jìn)一步研究了組蛋白乙?；揎椀淖兓瘜?duì)早期IVF和核移植胚發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，IvF胚胎經(jīng)TSA連續(xù)處理后，基因表達(dá)水平顯著提高，2-細(xì)胞胚發(fā)育到4-細(xì)胞階段的能力受到明顯抑制。然而，核移植胚激活前和激活后連續(xù)

9、TSA處理，核移植胚的2-細(xì)胞和4-細(xì)胞發(fā)育率分別為90.2％(110/122)和68.9％(84/122)，與未經(jīng)處理的核移植胚對(duì)照組相比，發(fā)育率均顯著提高(P<0.05)，尤其4-細(xì)胞的發(fā)育率增加了52.4％。核移植胚TSA誘導(dǎo)組蛋白高度乙酰化后導(dǎo)致2-細(xì)胞階段的基因表達(dá)水平顯著升高，且接近于IVF胚胎的基因表達(dá)水平。這可能是導(dǎo)致核移植胚發(fā)育率升高的一個(gè)主要原因。然而，組蛋白高度乙?；T導(dǎo)的IVF 2-細(xì)胞胚基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄物的增加，