2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景:充足的腦血流量對于維持大腦功能正常運轉(zhuǎn)至關(guān)重要,慢性腦低灌注(Chronic cerebral hypoperfusion,CCH)表現(xiàn)為腦血流量持續(xù)減少,作為多種腦血管疾病發(fā)展的共同病理過程,可導致認知功能減退。然而,CCH致認知功能障礙發(fā)病機理不完全清楚,尚無特效藥物和治療手段,因此,積極尋找預防、治療策略是臨床亟待解決的重要課題。
  研究發(fā)現(xiàn),CCH致認知功能障礙的機制復雜,主要的病理過程包括缺血導致細胞能量缺失、腦

2、白質(zhì)損傷、神經(jīng)發(fā)生受損、血腦屏障破壞、脂質(zhì)代謝和神經(jīng)血管單元功能紊亂、細胞壞死和凋亡等。神經(jīng)元作為CNS中最小的功能單元,一定數(shù)量及功能正常的神經(jīng)元是學習記憶的基礎(chǔ)。CCH中,神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡、壞死等一系列的病理生理學變化,進而導致大腦高級神經(jīng)功能損傷,如運動功能損傷、認知能力下降等。CCH致神經(jīng)元損傷,前額葉皮層(Prefrontal cortex,PFC)和海馬(Hippocampus,Hipp)是最受關(guān)注的腦區(qū),被認為是CCH后認

3、知功能受損害的形態(tài)學基礎(chǔ)。PFC和Hipp是參與空間學習記憶的中樞腦區(qū),PFC和Hipp對缺血缺氧十分敏感,長期缺血導致該部位神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)的損害;其結(jié)構(gòu)異常與學習記憶能力等行為學改變關(guān)系密切,進而引起學習記憶能力的下降,甚至癡呆。因此,研發(fā)可促進腦缺血后PFC和Hipp區(qū)神經(jīng)元存活的措施,如神經(jīng)保護劑,對認知功能障礙的治療具有重要意義。
  祖國醫(yī)學一直致力于研究、開發(fā)用于CCH預防、治療的藥物,其中人參(Radix Gins

4、eng)為常用的經(jīng)典藥物之一。人參隸屬于五加科(Araliaceae),常用作功能性保健食品的替代或補充用藥,亦用于抗癌、抗糖尿病和抗炎治療;同時,人參具有良好的神經(jīng)保護作用。人參皂苷Rd(Ginsenoside Rd,GSRd)是人參中的主要活性成分之一,大量研究證實,GSRd保護腦缺血及神經(jīng)退行性病變模型中的神經(jīng)元、改善動物的空間學習能力并預防記憶喪失,但其基本的機制仍然未知。近期研究證實,人參皂苷的神經(jīng)保護作用與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

5、(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF)的生成關(guān)系密切。BDNF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白,在神經(jīng)可塑性、神經(jīng)元再生和細胞存活中起關(guān)鍵作用,常于缺氧或缺血后釋放以保護腦免受損傷。臨床常用藥物能夠發(fā)揮增強記憶、神經(jīng)保護作用等,部分得益于促進或提高BDNF的表達。然而,人參皂苷是如何調(diào)控BDNF、它是否可通過 BDNF發(fā)揮神經(jīng)保護作用目前尚不清楚。
  多種機制參與調(diào)控BDNF的表達,其中表觀遺傳

6、學修飾機制因是多種分子的共同上游調(diào)控機制而備受關(guān)注。表觀遺傳學修飾機制包含組蛋白的乙?;揎?、DNA的甲基化修飾、非編碼RNA調(diào)控和染色質(zhì)重塑等,影響基因表達、調(diào)節(jié)細胞周期等。其中,組蛋白乙?;{(diào)控被證實參與動物學習記憶活動的形成和維持。組蛋白乙酰化為一種高度動態(tài)的調(diào)節(jié)過程,主要在兩類酶,即組蛋白去乙?;福℉istone deacetylase,HDAC)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferase,HAT)

7、的作用下實現(xiàn)。一般情況下,HDAC抑制基因的表達,而HAT促進基因的表達。因此,本課題擬在小鼠CCH模型中,探討GSRd是否可通過改變組蛋白乙?;揎?,調(diào)控BDNF表達,從而發(fā)揮對PFC和Hipp區(qū)神經(jīng)元的保護作用。
  目的:以CCH小鼠為研究對象,探討GSRd通過增加BDNF的生成,提高神經(jīng)元存活,用于治療CCH致認知功能障礙的分子機制。進一步,通過體外細胞培養(yǎng)體系模擬CCH病理狀態(tài),闡明組蛋白乙?;揎椪{(diào)控GSRd介導的BD

8、NF生成過程、參與GSRd促神經(jīng)元存活,從而改善CCH引起的學習記憶障礙的分子機制,為臨床治療CCH造成的認識功能障礙提供新思路和可能的治療手段。
  方法:
  1.微彈簧圈法造成雙側(cè)頸動脈狹窄(Bilateral Carotid Artery stenosis,BCAS)建立CCH小鼠模型;Morris水迷宮行為學評價CCH是否導致小鼠學習記憶功能障礙,進而給予GSRd治療21d,是否可改善CCH導致的小鼠學習記憶障礙。

9、
  2.蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE)染色觀察,給予或不給予GSRd治療CCH小鼠的PFC、CA1區(qū)域神經(jīng)元形態(tài)、存活率變化;采用Western blot方法,檢測CCH模型小鼠腦內(nèi)凋亡信號Caspase-3蛋白表達的變化,并觀察給予GSRd治療后是否逆轉(zhuǎn)這些蛋白的表達。
  3.實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme L

10、inked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測各組小鼠海馬中BDNF的表達變化,探討GSRd神經(jīng)保護作用可能的機制。
  4.體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,建立氧糖剝奪模型(Oxygen-glucose deprivation,OGD)模擬CCH模型,采用噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium bromide,MTT)、乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LD

11、H)檢測細胞活力、流式細胞技術(shù)(Flow Cytometry,FCM)檢測神經(jīng)元的凋亡現(xiàn)象,以及給予不同濃度梯度GSRd時神經(jīng)元存活率的變化;采用Western blot方法,檢測細胞內(nèi)凋亡信號Caspase-3蛋白表達的變化,評估體外GSRd的神經(jīng)保護能力。
  5.采用培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型,qPCR、ELISA法,觀察不同濃度梯度GSRd對BDNF表達量的影響。
  6.采用Western blot方法,檢測給予或不給予

12、GSRd治療后,CCH小鼠腦中p300/CBP結(jié)合蛋白(CREB binding proteins,CBP)、組蛋白H3乙?;ˋcetylated Histone H3,Ac-H3)、組蛋白去乙?;?(histone deacetylase2,HDAC2)表達水平的變化,旨在探究BDNF表達調(diào)控的上游表觀遺傳修飾機制。
  7.體外采用培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型,進一步確認GSRd對Ac-H3、HDAC2表達水平變化的影響,分析對B

13、DNF表達的上游調(diào)控機制。
  8.采用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)方法,觀察GSRd介導的BDNF表達增加是否通過促進Ac-H3與BDNF啟動子IV區(qū)域的結(jié)合,或降低HDAC與BDNF啟動子IV區(qū)域的結(jié)合實現(xiàn);進一步,預先給予HDAC的抑制劑MS-275,觀察是否可增強該效應(yīng),進而最終影響B(tài)DNF的表達。
  結(jié)果:
  1.Morris水迷宮結(jié)果顯示,與假

14、手術(shù)組相比,CCH導致小鼠學習記憶障礙,表現(xiàn)為小鼠搜索平臺時間(潛伏期)延長,目標象限游泳距離百分比降低,穿越平臺次數(shù)減少(P?0.01);與模型組相比,GSRd治療后,顯著改善CCH導致的小鼠空間學習記憶障礙(P<0.05或P<0.01)。
  2.HE染色結(jié)果證實,與假手術(shù)組相比,CCH模型小鼠的PFC、CA1區(qū)域神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)不清晰,出現(xiàn)細胞核固縮和大量細胞凋亡(P<0.01);與CCH模型組相比,給予GSRd治療后神經(jīng)元的形

15、態(tài)結(jié)構(gòu)與正常相似,細胞凋亡的比例下降(P<0.01);Western blot方法CCH小鼠腦內(nèi)凋亡信號Caspase-3蛋白表達增加,給予GSRd治療后降低Cleaved Caspase-3的表達(P<0.05或P<0.01)。
  3.qPCR、ELISA法檢測發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,CCH小鼠海馬中BDNF的mRNA和蛋白表達水平顯著下降(P<0.01);與模型組相比,GSRd治療后BDNF的表達可恢復至近正常水平。
 

16、 4.MTT、LDH、FCM結(jié)果顯示,培養(yǎng)的神經(jīng)元經(jīng)OGD損傷后,神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡,存活率顯著下降(P<0.01),不同濃度GSRd處理則能提高細胞存活(P<0.05或P<0.01);同時,GSRd處理能夠降低OGD條件下凋亡信號Caspase-3蛋白的高表達(P<0.05或P<0.01),提示GSRd的體外亦具有神經(jīng)保護作用。
  5.與體內(nèi)結(jié)果一致,采用體外培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型,亦觀察并確認不同濃度GSRd處理后,BDNF表達量

17、增加(P<0.05或P<0.01),提示體外GSRd的神經(jīng)保護作用可能通過增加BDNF的表達實現(xiàn)。
  6. Western blot方法分析BDNF表達調(diào)控的上游組蛋白修飾機制,結(jié)果顯示,CCH損傷后,與假手術(shù)組相比,小鼠腦中p300/CBP、Ac-H3水平顯著下降(P<0.01),而HDAC2表達水平升高(P<0.01);給予GSRd治療后,則能逆轉(zhuǎn)這些調(diào)控BDNF表達的上游蛋白的異常表達(P<0.01)。
  7.進一

18、步采用培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型,確認BDNF表達調(diào)控的上游組蛋白修飾機制,結(jié)果顯示,與對照組相比,OGD/R組神經(jīng)元Ac-H3表達水平顯著下降(P<0.01),而HDAC2表達水平顯著上升(P<0.01);GSRd處理后則可逆轉(zhuǎn)這些上游蛋白的異常表達(P<0.01)。
  8.ChIP法結(jié)果顯示,OGD損傷促進HDAC2與BDNF啟動子IV區(qū)域的結(jié)合,而降低Ac-H3與BDNF啟動子IV區(qū)域的結(jié)合,導致BDNF的表達顯著降低;給予GS

19、Rd處理后則可促進Ac-H3、降低HDAC與BDNF啟動子IV區(qū)域的結(jié)合,使BDNF的表達恢復正常;進一步研究發(fā)現(xiàn),預先給予HDAC的抑制劑MS-275,則可增強GSRd介導的該效應(yīng)。該結(jié)果提示,OGD損傷條件下,BDNF的表達受到組蛋白修飾的調(diào)節(jié)。
  結(jié)論:
  1.GSRd改善CCH導致的學習記憶障礙,并減輕CCH小鼠PFC和Hipp神經(jīng)元的凋亡,該效應(yīng)與CCH小鼠腦內(nèi)BDNF表達增加相關(guān);BDNF的表達受到P300/

20、CBP、Ac-H3和 HDAC2參與的組蛋白乙?;恼{(diào)節(jié)。故GSRd通過表觀遺傳學調(diào)控BDNF的表達,保護CCH時神經(jīng)元免受損傷,從而改善空間記憶能力。
  2.體外研究證實,暴露于OGD/R導致神經(jīng)元活力喪失,GSRd則對培養(yǎng)神經(jīng)元起到神經(jīng)保護作用。GSRd通過上調(diào)BDNF的表達,降低了OGD/R誘導的細胞活力喪失和LDH釋放,這與形態(tài)分析和凋亡的Caspase-3指標一致。OGD/R處理足以增加HDAC2、減少Ac-H3,同時

21、伴隨BDNF表達的下降;GSRd處理可逆轉(zhuǎn)上述種種變化,提示 GSRd可能通過重建Ac-H3與HDAC2之間的平衡,參與BDNF轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),促進神經(jīng)元存活。
  3. BDNF啟動子IV區(qū)域受到組蛋白修飾機制的調(diào)控,作為HDAC的抑制劑——MS-275,與GSRd之間具有協(xié)同作用。
  上述結(jié)果提示,在CCH小鼠模型中,GSRd提供神經(jīng)保護作用可能是通過組蛋白乙?;揎棛C制對BDNF進行調(diào)控而實現(xiàn)的,從而揭示了GSRd神經(jīng)保護

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