組蛋白乙?；诒窍⑷獍l(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、第一部分:組蛋白乙?；?去乙酰化酶活性在鼻息肉中的變化
　　目的:評(píng)估組蛋白乙?；福╤istone acetyltransferases HATs）和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetyltransferases HDACs)活性在鼻息肉組織中的變化，并檢測(cè)HDACs基因在鼻息肉組織中的表達(dá)變化。
　　方法:收集2012年6月-2012年11月期間復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院鼻息肉和正常鼻黏膜組織標(biāo)本，提取新鮮

2、組織的核蛋白，分別利用HATs和HDACs活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)組織核蛋白HATs和HDACs活性，同時(shí)通過免疫組化的方法比較組蛋白乙酰化程度在鼻息肉和正常鼻黏膜中的差異;另外，提取鼻息肉和正常鼻黏膜組織總RNA，利用熒光定量PCR方法檢測(cè)HDACs基因在鼻息肉和正常鼻黏膜組織表達(dá)變化。
　　結(jié)果:收集新鮮鼻息肉標(biāo)本20例，正常鼻黏膜標(biāo)本6例;成功提取新鮮組織的核蛋白。HATs和HDACs活性檢測(cè)結(jié)果顯示在正常鼻黏膜中，HAT/HDA

3、C為1.19±0.33，鼻息肉組織中HAT/HDAC為1.95+0.57(P＜0.01)，提示鼻息肉中存在HAT/HDAC失平衡。HDACs活性檢測(cè)顯示鼻息肉中HDACs活性為0.16±0.07/80ug，明顯低于正常鼻黏膜組織HDACs活性（0.35±0.08/80ug）(P＜0.01)，HATs活性未見顯著差異;免疫組化結(jié)果顯示鼻黏膜和鼻息肉組織中黏膜上皮層乙?；旧栃?，特別是鼻息肉上皮層乙酰化明顯增強(qiáng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果提示

4、HDACs基因在鼻息肉組織中表達(dá)與正常對(duì)照組之間無明顯差異(P＞0.05)，提示鼻息肉組織中HDACs活性降低與HDACs基因表達(dá)無直接相關(guān)性。
　　結(jié)論:鼻息肉組織中HDACs活性降低導(dǎo)致蛋白乙酰化增強(qiáng)，HDACs活性降低與HDAC基因的表達(dá)無直接相關(guān)性，鼻息肉組織中HAT/HDAC平衡向乙?；鰪?qiáng)的方向偏移，提示HAT/HDAC活性改變可能參與了鼻息肉的發(fā)生和發(fā)展。
　　第二部分:病原微生物對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞乙酰化及HDA

5、Cs基因表達(dá)的影響
　　目的:研究外界病原微生物對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞乙?；癏DACs基因表達(dá)的影響。
　　方法:取正常鼻黏膜，利用0.01％蛋白酶XIV消化法分離上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別利用細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharides LPS)和聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸Poly(I∶C)刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞，利用CCK-8檢測(cè)不同濃度的刺激因素對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞活性的影響。刺激上皮細(xì)胞24h后分別收集細(xì)胞上清和細(xì)胞總RNA，利

6、用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ELISA）測(cè)定鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)的水平反映刺激因素對(duì)上皮細(xì)胞的激活作用;通過細(xì)胞免疫熒光的方法研究LPS和Poly(I∶C)的刺激對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞乙酰化的影響;提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LPS和poly(I∶C)刺激對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞HDACs基因表達(dá)的影響

7、。
　　結(jié)果:利用0.01％蛋白酶XIV消化分離的方法能夠成功分離培養(yǎng)鼻黏膜上皮細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察見貼壁生長(zhǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞呈鋪路石樣形態(tài);細(xì)胞培養(yǎng)約7d后可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)2-3代的上皮細(xì)胞依然保持上皮細(xì)胞的形態(tài)和增殖特性;細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)顯示LPS≥15ug/ml和Poly(I∶C)≥25ug/ml會(huì)影響鼻黏膜上皮細(xì)胞的活性。LPS(10ug/ml)和Poly(I∶C)(20ug/ml)刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞24h后可激活上

8、皮細(xì)胞，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞分泌IL-6和IL-8水平顯著升高;細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示LPS和Poly(I∶C)刺激均可引起鼻黏膜上皮細(xì)胞乙酰化，刺激所引起的蛋白乙?；粌H局限在細(xì)胞核，細(xì)胞漿內(nèi)亦出現(xiàn)蛋白乙?；?熒光定量PCR結(jié)果顯示LPS和Poly(I∶C)刺激并未引起HDACs基因表達(dá)變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論:LPS(10ug/ml)和Poly(I∶C)(20ug/ml)刺激24h可導(dǎo)致鼻黏膜上皮細(xì)胞蛋白乙?；鰪?qiáng)，引起細(xì)胞核

9、蛋白和細(xì)胞漿蛋白乙?；鰪?qiáng)。但LPS和Poly(I∶C)刺激并未引起HDACs基因表達(dá)的變化。
　　第三部分:抑制HDACs活性對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和LL37的影響
　　目的:探討抑制HDACs活性對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8和抗菌肽LL37的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)鼻黏膜上皮細(xì)胞，同時(shí)培養(yǎng)下呼吸道上皮細(xì)胞系NCI-H292細(xì)胞作為平行對(duì)照;利用HDACs抑制劑TSA或SB抑制上皮細(xì)胞HD

10、ACs活性，然后利用Poly(I∶C)刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分六組:TSA單獨(dú)刺激組;SB單獨(dú)刺激組;Poly(I∶C)單獨(dú)刺激組;TSA+ Poly(I∶C)聯(lián)合刺激組;SB+ Poly(I∶C)聯(lián)合刺激組;上皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組。刺激24h后收集細(xì)胞上清、提取細(xì)胞總RNA和細(xì)胞總蛋白，利用ELISA檢測(cè)HDACs抑制劑對(duì)不同組鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-8水平的影響;利用熒光定量PCR方法檢測(cè)不同刺激因素對(duì)上皮細(xì)胞表達(dá)抗菌肽LL

11、37的影響;通過western-blot方法分析抑制HDACs活性對(duì)LL37蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:熒光定量PCR的結(jié)果顯示TSA(200nM)和SB(4mM)能夠誘導(dǎo)LL37基因的表達(dá)，并且這種促進(jìn)作用是不依賴于Poly(I∶C)的刺激; western-blot的結(jié)果顯示TSA和SB可誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞LL37蛋白表達(dá)增加，而對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞、LL37蛋白的表達(dá)無明顯影響;ELISA檢測(cè)顯示TSA或SB作用于上皮細(xì)胞