STAT3信號通路在鼻息肉發(fā)病機制中作用的初步研究.pdf

1、目的及背景:鼻息肉(nasal polyposis，NP)是一種鼻部黏膜的炎癥性疾病，在鼻科臨床上呈多發(fā)態(tài)勢，根據(jù)歐洲的鼻竇炎及鼻息肉治療指南(Ep3OS)，鼻息肉被認為是慢性鼻-鼻竇炎(chronic sinusitis，CRS)的一個亞型。由于該病較高的復發(fā)率及目前治療手段無法達到完全根治該病，鼻息肉已成為嚴重降低人類生活質量并帶來大量社會經(jīng)濟負擔的全球性健康問題。
　　對NP發(fā)病機制的研究在近幾十年是鼻部炎癥性疾病研究領域的

2、重點，國內外學者們對NP的起病原因及相關機制進行了大量的科學研究，盡管對于其疾病機理仍不能徹底地的予以明確，但是幾乎所有的研究均表明:鼻息肉的形成是一個多種因素參與、多步驟發(fā)展的過程，慢性持續(xù)性炎癥與變態(tài)反應與之關系密切。而Th淋巴細胞，尤其是Th17細胞在中國人鼻息肉的發(fā)病過程中扮演了重要的角色，而且變應性因素在中國人鼻息肉中很可能通過影響Th17細胞的反應發(fā)揮了關鍵作用。
　　作為一種關鍵的核轉錄因子，在胞外信號的作用下，ST

3、AT3的酪氨酸基團被JAK磷酸化，以二聚體的形式進入胞核內，與胞核中特異的基因片段相結合，調節(jié)下游基因及相關蛋白的表達。近年的研究發(fā)現(xiàn)STAT3信號通路在IL-6的刺激下參與Th17細胞的增殖活化，由 STAT3介導下引起的Th17細胞反應在葡萄膜炎、克羅恩病、哮喘等免疫及炎癥性疾病的發(fā)病中發(fā)揮關鍵作用。那在中國，作為同樣是Th17細胞反應為主的NP中，STAT3信號通路的異常激活是否也存在呢？變應性因素對NP中Th17細胞反應的影響與

4、其與NP中STAT3通路的活化狀態(tài)的關系有關聯(lián)嗎？
　　為研究上述疑問，本研究以已經(jīng)明確診斷的NP患者作為實驗的對象，并將他們按照個體有無變應性的標準而分為atopic NP和non-atopicNP兩個組，以STAT3信號通路相關關鍵因子的異常激活為支撐點，研究分析在中國西南地區(qū)的漢族人群中，不同類型NP的局部炎癥特性與免疫機制，以解釋在atopic和non-atopic NP發(fā)病機制中STAT3信號通路所起的作用，同時探討變應

5、性因素在NP中的作用與STAT3信號通路是否相關。本實驗將從新的研究途徑研究NP的發(fā)病機制，完善中國人NP是以Th17細胞反應為主這一理論，為NP的研究與治療提供新的方向與靶點。
　　第一部分STAT3信號通路相關因子在伴和不伴變應性體質鼻息肉患者中表達的研究。
　　目的:通對檢測atopic和non-atopic NP兩組患者息肉組織中STAT3信號通路中代表激活的關鍵因子及其下游Th17細胞在RNA、蛋白水平的相關因子的

6、表達。觀察兩組患者鼻腔鼻竇病變局部STAT3信號通路的異常激活狀態(tài)、Th17細胞反應狀態(tài)及兩組間的異同。旨在探討 STAT3信號通路的異常激活在NP發(fā)病機制中的意義，及NP中變應性因素對Th17反應的影響與STAT3信號通路的異常激活之間的關系。
　　方法:對atopic-NP組20例，non-atopic NP組20例及對照的下鼻甲組織10例，采用免疫組化及Western Blot方法檢測兩組NP組織中pSTAT3及SOCS3的

7、表達;采用ELISA檢測NP組織中IL-6、sIL-6R、IL-17的表達;采用real-time PCR檢測NP組織中RORc的表達;采用免疫熒光雙標方法檢測NP局部組織中CD4+RORc+細胞的表達。同時，以相關性分析的方法統(tǒng)計分析息肉組織中Th17細胞及其相關因子與STAT3信號通路的關鍵因子的關系。
　　結果: NP患者息肉組織中RORc、IL-17及CD4+RORc+細胞的水平比對照組明顯上升，在atopic NP組比另

8、一NP組的表達更高，差距有統(tǒng)計學意義;與對照組相比，NP患者息肉組織中IL-6、sIL-6R、pSTAT3及SOCS3的表達顯著升高，且在atopic NP組pSTAT3的表達顯著高于non-atopic NP組，SOCS3的表達在atopic NP組顯著低于non-atopic NP組，而在這兩組NP中的IL-6與sIL-6R的水平的差異無統(tǒng)計學意義;在NP組織中，pSTAT3的表達水平與RORc、IL-17及CD4+RORc+細胞水

9、平呈正相關，SOCS3的表達與pSTAT3的水平呈負相關，而IL-6與sIL-6R的水平與息肉組織中SOCS3的表達與pSTAT3的水平相關性無統(tǒng)計學意義。
　　結論:STAT3信號通路的異常激活及其下游Th17細胞反應的亢進存在于NP中，其在NP的發(fā)病機制中起到關鍵作用;且NP患息肉組織中STAT3信號通路關鍵因子與Th17細胞相關因子基本上消長一致，說明STAT3信號通路的異常激活在Th17細胞反應過度亢進過程中扮演關鍵角色;

10、Atopic NP存在更為嚴重的STAT3信號通路的異常激活和更為嚴重的Th17細胞反應的亢進，說明變應性因素可能通過影響STAT3信號通路的異常激活推動Th17反應的進一步亢進，從而促進有更嚴重臨床病理特征的NP的發(fā)生發(fā)展。而SOCS3的表達差異可能是引起atopic NP組與non-atopic NP組出現(xiàn)IL-6及sIL-6R的水平與其下游的細胞因子的表達消長不統(tǒng)一的原因。本文從以下三部分進行了論述。
　　第二部分STAT3

11、抑制劑阻斷鼻息肉中STAT3信號通路后相關下游因子表達的實驗研究。
　　目的:通過不同濃度的STAT3信號通路抑制劑AG490作用于NP組織單細胞懸液，觀察阻斷NP中STAT3信號通路后對NP局部組織的Th17細胞及其相關因子的影響，并分析不同濃度下Th17細胞相關因子表達有無差異。以期在前一部分實驗基礎之上進一步探討STAT3信號途徑在NP發(fā)病中的作用，從體外研究的方面證明STAT3信號途徑在中國人NP的發(fā)病中扮演的關鍵角色。<

12、br>　　方法:用不同濃度的STAT3通路抑制劑AG490體外作用培養(yǎng)于20例NP組織單細胞懸液（atopic NP10例，non-atopic NP10例）48h，根據(jù)濃度分為低濃度組(50μM)與高濃度組(100tM)，以PBS代替AG490干預作為對照組。采取流式細胞術分析各組標本中Th17細胞的分布，運用real-time PCR檢測各組RORc的水平，以ELISA方法檢測各組中IL-17的水平。
　　結果:用AG490處

13、理48h后，AG490作用組的Th17細胞及相關因子（RORc及IL-17）的表達較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義;且的Th17細胞及相關因子（RORc及IL-17）的表達水平在高濃度AG490作用組較低濃度AG490作用組的水平有明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:在NP中STAT3信號通路的激活與Th17細胞的亢進反應密切相關，AG490阻斷STAT3活化可顯著下調RORc及IL-17的表達，抑制NP中的Th17細胞反應

14、。上述結果從體外實驗方面證實STAT3信號通路是通過影響Th17細胞反應來促進NP的發(fā)生發(fā)展，在NP的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。
　　第三部分塵螨變應原體外刺激對鼻息肉患者STAT3信號通路相關因子局部表達的影響。
　　目的:采用塵螨特異性變應原(HDM)作為刺激原，在體外短時期內刺激并培養(yǎng)患者NP組織單細胞懸液中的單個核細胞，觀察變應原體外刺激后，對兩組NP患者STAT3信號通路的影響，分析兩組間STAT3信號通路相關因子表

15、達變化的差異，在前兩部分實驗基礎上進一步闡述變應性因素對兩組患者STAT3信號通路異常激活的影響，體外證實變應性因素是通過影響STAT3信號通路異常激活來促進TH17細胞的亢進反應從而在NP發(fā)病機制中發(fā)揮作用的。
　　方法:分別以大劑量HDM+PHA及單純PHA，對atopic和non-atopic NP患者局部NP組織單細胞懸液中細胞予以體外刺激培養(yǎng)48h，采用Western Blot方法檢測兩組NP組織中pSTAT3的表達，R

16、eal-time PCR方法及Western Blot方法檢測SOCS3的表達，并分析兩組間差異。
　　結果:HDM+PHA刺激后的NP組患者局部NP組織單細胞懸液細胞中pSTAT3及SOCS3的表達較對照組明顯上升，且在NP組內，變應性NP組的pSTAT3水平比非變應性NP組明顯上升，而變應性NP組SOCS3的表達水平則較非變應性NP組顯著下降;此外，在atopic NP組，HDM+PHA刺激使pSTAT3表達水平較PHA刺激顯

17、著升高，而SOCS3的表達水平較PHA刺激顯著降低;而non-atopic NP組與對照組經(jīng)HDM+PHA刺激和經(jīng)PHA刺激對pSTAT3及SOCS3的表達水平影響差異無顯著性。
　　結論:伴變應性的NP患者的局部NP組織中HDM可誘導STAT3相關因子表達上調，揭示了STAT3信號通路在變應性上氣道炎癥中的重要作用，證實了變應性因素可通過影響STAT3信號通路在NP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用;此外，在atopic NP組HDM誘導的S