組蛋白乙酰化修飾對牙髓細胞成牙本質(zhì)分化調(diào)控的初步研究.pdf

1、目的:
　　1.分離培養(yǎng)人牙髓干細胞，通過誘導(dǎo)分化、RNA干擾等手段揭示DSPP在牙髓干細胞成牙本質(zhì)分化中所起的作用
　　2.通過蛋白免疫印記(westernblot)，分析牙髓干細胞分化前后組蛋白H3乙?；潭鹊牟町悾醪教接懫湓谘浪韪杉毎裳辣举|(zhì)分化中可能的作用機制。
　　方法:
　　1.改良組織塊法從人離體牙中獲得牙髓細胞，運用有限稀釋法進行分離、培養(yǎng)，得到的細胞經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定細胞表型，并在成骨/成牙本質(zhì)

2、誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加以誘導(dǎo)后，通過ALP定量，茜素紅染色等檢測是否有礦化，同時在mRNA水平上運用實時定量PCR技術(shù)，檢測成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)的基因表達情況，來確定牙髓細胞的成牙本質(zhì)分化。
　　2.運用RNA干擾技術(shù)，對DSPP這一成牙本質(zhì)細胞特異的基因，構(gòu)建其siRNA慢病毒載體后，實時定量PCR檢測其干擾效率，并在其成骨誘導(dǎo)后，在ALP定量及mRNA水平檢測成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因的表達，茜素紅染色檢測礦化程度的變化。
　　3.通

3、過westernblot法，對誘導(dǎo)前后的牙髓于細胞中組蛋白H3的乙?；竭M行檢測，以分析是否有表觀遺傳修飾參與牙髓干細胞的分化過程。
　　4.通過化合物Garcinol抑制組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶的作用，來達到下調(diào)組蛋白乙?；哪康模诖嘶A(chǔ)上對成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因的表達及相關(guān)礦化指標(biāo)進行檢測，以反向驗證其相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.通過改良組織塊法及有限稀釋法獲得的細胞呈現(xiàn)長梭狀，成纖維細胞樣，并有集群形成能力，且具

4、有相關(guān)干細胞表型（Stro-1，CD-29，CD-146，CD105），符合牙髓干細胞(DPSCs)的基本生物學(xué)特征。其經(jīng)過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，ALP，RUNX2，BSP，OCN及DSPP的表達均明顯上調(diào)，茜素紅染色顯示有礦化結(jié)節(jié)形成，說明成牙本質(zhì)分化誘導(dǎo)成功。
　　2.成功構(gòu)建了pLVX-DSPP-shRNA慢病毒，導(dǎo)入牙髓干細胞后能顯著抑制DSPP表達。通過多項檢測，ALP及RUNX2，BSP，OCN等成骨因子的表達均無顯

5、著變化，而茜素紅染色顯示礦化結(jié)節(jié)形成明顯減少，說明礦化能力下降，細胞增殖活性也有所下降。
　　3.礦化誘導(dǎo)能顯著刺激牙髓干細胞組蛋白乙?；降纳仙?。
　　4.在組蛋白乙?；敢种苿〨arcinol的刺激下，乙酰化組蛋白H3的表達量明顯下降，并且ALP，RUNX2，BSP，OCN及DSPP等成骨/礦化因子均顯著下調(diào)，同時茜素紅染色顯示礦化結(jié)節(jié)形成也受到了阻礙，細胞增殖活性明顯下降。
　　結(jié)論:
　　體外分離培養(yǎng)的