孕期酒精暴露致胎鼠心臟發(fā)育基因表達異常的組蛋白乙?；{(diào)控機制.pdf

1、第一部分:孕期酒精暴露對胎鼠心臟發(fā)育相關(guān)核心轉(zhuǎn)錄因子組蛋白乙酰化修飾的影響
　　目的:
　　探討孕期酒精暴露對HATs和HDACs活性及心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5的組蛋白乙?；揎棤顟B(tài)的影響。
　　方法:
　　受孕ED8.5的昆明小鼠隨機分為空白對照組和酒精組，酒精組于ED8.5給予56％酒精（5mg/kg·d）連續(xù)灌胃1周，空白對照組給予等量生理鹽水灌胃，收集ED14.5和E

2、D16.5胎鼠心臟及PND0.5和PND7新生鼠心臟進行如下檢測：
　?。?）比色法檢測HATs和HDACs的活性；
　?。?）Western blot檢測心臟組織中組蛋白H3AcK9及ac-H3的乙酰化水平；
　?。?）ChIP-Q-PCR檢測心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5啟動子區(qū)域組蛋白ac-H3、H3AcK9乙?；剑?br>　?。?）運用頂空氣相色譜法檢測孕鼠血液酒精濃度，并觀

3、察酒精相關(guān)副作用。
　　結(jié)果:
　?。?）以5mg/kg劑量酒精灌胃孕鼠40分鐘后，其血液酒精濃度達到147.5mg/100ml，且該劑量酒精所導(dǎo)致的流產(chǎn)、死胎及腸脹氣的發(fā)生率約為15%。隨著酒精劑量的增加其血液酒精濃度及相關(guān)副作用的發(fā)生率也逐漸增加。
　　（2）比色法結(jié)果顯示在胎鼠心臟發(fā)育的ED14.5、ED16.5、PND0.5酒精可以提高胎鼠及新生鼠心肌組織中HATs活性，與空白對照組相比差異顯著（P<0.05）

4、，而對心肌組織中HDACs活性無明顯影響，與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　?。?）Western blot結(jié)果顯示孕期酒精暴露可以顯著提高胎鼠及新生鼠心肌組織中組蛋白ac-H3及H3AcK9乙?；剑≒<0.05）。
　?。?）ChIP-Q-PCR結(jié)果顯示孕期酒精暴露可以顯著提高胎鼠和新生鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5啟動子區(qū)域組蛋白ac-H3和H3AcK9乙?；剑≒

5、<0.05）。
　　結(jié)論:
　?。?）孕期酒精暴露可以選擇性地提高胎鼠及新生鼠心肌組織中HATs活性，而對HDACs活性無顯著影響。
　?。?）孕期酒精暴露可以顯著提高心肌組織中組蛋白ac-H3和H3AcK9乙?；?。
　?。?）孕期酒精暴露可導(dǎo)致心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5、TBX5啟動子區(qū)域組蛋白ac-H3和H3AcK9高乙?；癄顟B(tài)。
　　第二部分:組蛋白乙?；笇π呐K發(fā)育相關(guān)

6、轉(zhuǎn)錄因子的組蛋白乙?；{(diào)控作用
　　目的:探討HATs對心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5啟動子區(qū)域組蛋白乙?；{(diào)控作用。同時揭示酒精暴露所致的組蛋白高乙?；瘜π呐K核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　方法:
　?。?）選取正常ED14.5胎鼠為研究對象，針對心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5啟動子區(qū)域前1000bp設(shè)計特

7、異性引物，分別以ChIP級抗p300、CBP、PCAF、SRC1、GCN5抗體做ChIP-PCR檢測HATs各個亞型對上述心臟核心轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。
　?。?）收集ED14.5、ED16.5胎鼠心臟及PND0.5、PND7新生鼠心臟；實驗設(shè)立空白對照組和酒精暴露組，針對心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5啟動子區(qū)域前1000bp設(shè)計特異性引物，分別以ChIP級抗p300、CBP、PCAF、SRC1、GC

8、N5抗體行ChIP-Q-PCR檢測酒精對上述心臟核心轉(zhuǎn)錄因子啟動子區(qū)域HATs各個亞型結(jié)合量的影響。
　　（3）收集ED14.5、ED16.5胎鼠心臟及PND0.5、PND7新生鼠心臟；實驗設(shè)立空白對照組和酒精暴露組，針對心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、NKX2.5、MEF2C和TBX5 CDS核心編碼區(qū)設(shè)計特異性引物，運用實時定量RT-PCR檢測上述心臟核心轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達水平。
　　結(jié)果:
　?。?）ChIP-PC

9、R結(jié)果顯示HATs亞型p300、CBP、PCAF、SRC1及GCN5均能結(jié)合到心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5啟動子區(qū)域。
　　（2）酒精暴露組HATs亞型p300、CBP、PCAF、SRC1在心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5啟動子區(qū)域的結(jié)合量顯著增高，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而HATs亞型GCN5在上述轉(zhuǎn)錄因子啟動子區(qū)域的結(jié)合量酒精組與空白對照組比

10、較無顯著差異（P>0.05）。
　?。?）胎鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5的mRNA表達水平在酒精暴露組高于空白對照組，且在ED14.5、ED16.5胎鼠心肌組織中GATA4 mRNA及MEF2C mRNA表達水平酒精組與空白對照組相比差異顯著（P<0.05）；NKX2.5 mRNA表達量在ED14.5、ED16.5及PND0.5酒精組與空白對照組相比差異顯著（P<0.05）；TBX5 mRNA表

11、達量在ED14.5酒精組顯著高于空白對照組（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　?。?）生理狀態(tài)下HATs亞型p300、CBP、PCAF、SRC1及GCN5均可以結(jié)合到心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5啟動子區(qū)域，參與上述轉(zhuǎn)錄因子組蛋白乙酰化修飾調(diào)控。
　?。?）孕期酒精暴露可以顯著提高HATs亞型p300、CBP、PCAF、SRC1在心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX

12、5啟動子區(qū)域的結(jié)合量。
　?。?）孕期酒精暴露可以顯著提高胎鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C、NKX2.5及TBX5的轉(zhuǎn)錄活性。
　　第三部分:漆樹酸抑制組蛋白乙?；抡{(diào)酒精誘導(dǎo)的心臟發(fā)育相關(guān)基因的過表達
　　目的:探討HATs抑制劑漆樹酸通過抑制組蛋白乙?；揎棤顟B(tài)從而下調(diào)酒精誘導(dǎo)的心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5及心臟發(fā)育相關(guān)基因α-MHC、Cx43、cTnT、α-actin過表達的作用。
　　方

13、法:
　　選取昆明小鼠為研究對象，將ED8.5的孕鼠隨機分為空白對照組、空白對照+DMSO組、酒精組、酒精+DMSO組，酒精+DMSO+漆樹酸組、空白對照+DMSO+漆樹酸組。酒精組給予56%酒精（5mg/kg·d）連續(xù)灌胃1周，空白對照組給予等量生理鹽水灌胃，空白對照+ DMSO組給予等量生理鹽水灌胃的基礎(chǔ)上再給予等量DMSO腹腔注射，酒精+DMSO+漆樹酸組給予酒精（5mg/kg·d）灌胃，同時給予DMSO溶解的漆樹酸腹腔注射

14、（5mg/kg·d）；在ED14.5收集胎鼠心臟進行以下檢測：
　　（1）分別以抗HATs亞型p300、PCAF、SRC1抗體及抗H3AcK9抗體行染色質(zhì)免疫共沉淀，針對心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域設(shè)計特異性引物，運用Real-Time PCR擴增抗p300、PCAF、SRC1及H3AcK9抗體募集到的DNA片段，檢測p300、PCAF、SRC1在上述心臟核心轉(zhuǎn)錄因子啟動子區(qū)域的結(jié)合量及組蛋白H3AcK9乙?；?/p>

15、平。
　?。?）實時定量RT-PCR檢測心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5及心臟發(fā)育相關(guān)基因α-MHC、Cx43、cTnT、α-actin的 mRNA表達水平。
　?。?）Western blot檢測組蛋白H3AcK9乙?；郊靶呐K發(fā)育相關(guān)基因α-MHC、Cx43、cTnT、α-actin的蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　?。?）Western blot結(jié)果顯示酒精暴露組胎鼠心肌組織組蛋白H3AcK9乙?；?/p>

16、顯著高于空白對照組（P<0.05），ChIP-Q-PCR結(jié)果表明心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域組蛋白H3AcK9乙酰化水平在酒精暴露組顯著高于空白對照組（P<0.05），而漆樹酸能夠顯著抑制酒精所致的組蛋白高乙?；≒<0.05）。
　?。?）ChIP-Q-PCR結(jié)果表明心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域p300、PCAF、SRC1的結(jié)合量在酒精暴露組顯著高于空白對照組（P<0.05），漆樹酸能夠顯著降

17、低p300和PCAF在心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域的結(jié)合量（P<0.05）；但漆樹酸并不能降低SRC1在心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域的結(jié)合量（P>0.05）。
　?。?）實時定量RT-PCR結(jié)果顯示酒精暴露可以顯著提高心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5及心臟發(fā)育相關(guān)基因α-MHC、Cx43、cTnT mRNA表達水平（P<0.05），但酒精暴露并不能提高α-actin的mRNA表達水平（P>0

18、.05）；漆樹酸能夠顯著下調(diào)酒精暴露所致的GATA4、TBX5、α-MHC、Cx43、cTnT的mRNA過表達（P<0.05）。
　?。?）Western blot結(jié)果顯示孕期酒精暴露可以顯著提高胎鼠心臟發(fā)育相關(guān)基因α-MHC、Cx43、cTnT蛋白表達水平（P<0.05），但酒精暴露并不能提高α-actin的蛋白表達水平（P>0.05）。而漆樹酸能夠顯著下調(diào)酒精暴露所致的α-MHC、Cx43、cTnT的蛋白過表達（P<0.05）