曲古抑素A對(duì)人胎兒成纖維細(xì)胞OCT4啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及人類(lèi)體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育影響.pdf

1、目的：研究曲古抑素A(TSA)人胎兒成纖維細(xì)胞(hEFs)OCT4啟動(dòng)子DNA甲基化和人類(lèi)體細(xì)胞核移植(hSCNT)胚胎發(fā)育的影響 方法：hEFs(3×105cells/90-mm dish)在貼壁培養(yǎng)48小時(shí)后更換新鮮hEFs培養(yǎng)基，并添加終濃度為50，100，200，300，400，500，600，700和800nM的TSA分別作用24，48和72小時(shí)，未加TSA處理的hEFs作為陰性對(duì)照。 (1)采用細(xì)胞流式法檢測(cè)

2、細(xì)胞凋亡，評(píng)價(jià)TSA對(duì)hEFs的毒性作用與濃度和時(shí)間的關(guān)系； (2)應(yīng)用免疫組化法及RT-PCR分析TSA對(duì)多能性轉(zhuǎn)錄因子OCT4表達(dá)的影響； (3)應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)乙?；M蛋白H3水平，評(píng)價(jià)TSA對(duì)組蛋白乙?；降挠绊?； (4)應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)mRNA的表達(dá)水平分析TSA在DNA甲基化方面的作用； (5)通過(guò)重亞硫酸鹽PCR測(cè)序法(BSP)檢測(cè)了OCT4基因啟動(dòng)

3、子甲基化狀態(tài)用于評(píng)價(jià)TSA對(duì)hEFsOCT4基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)影響； (6)利用50nM的TSA處理hSCNT，觀察TSA對(duì)克隆胚發(fā)育的影響。 結(jié)果： (1)TSA對(duì)hEFs細(xì)胞的毒性作用呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，隨濃度增加細(xì)胞存活率降低；三個(gè)作用時(shí)間比較，TSA對(duì)hEFs的毒性作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； (2)免疫組化結(jié)果顯示，TSA處理組細(xì)胞oct4蛋白的表達(dá)陰性； (3)RT-PCR結(jié)果表明，TSA處理組細(xì)

4、胞OCT4 mRNA陰性，與oct4蛋白免疫組化結(jié)果一致； (4)TSA能夠明顯提高組蛋白乙酰化水平； (5)TSA對(duì)DNMT1 mRNA的表達(dá)具有抑制作用，隨TSA濃度增加抑制作用增強(qiáng)； (6)BSP結(jié)果顯示，100nM TSA處理細(xì)胞48小時(shí)OCT4啟動(dòng)子DNA甲基化水平與非處理組相似，而與hES相比仍處于高度甲基化狀態(tài)； (7)hSCNT重構(gòu)胚激活后，用50nM TSA處理4小時(shí)，≥8細(xì)胞克隆胚胎形