曲古抑菌素A誘導牛胎兒成纖維細胞凋亡的研究.pdf

1、自1997年首例體細胞核移植克隆綿羊多利誕生以來，哺乳動物體細胞核移植技術(shù)得到了快速發(fā)展，但目前克隆效率低下和胚胎發(fā)育異常等仍是體細胞克隆技術(shù)所遇到的突出問題。近年來研究表明，卵母細胞胞質(zhì)對供體細胞的表觀遺傳重編程不完全與發(fā)育異常的問題引起了人們的關(guān)注。人們嘗試使用影響DNA甲基化及組蛋白修飾等藥物處理供體細胞來提高克隆效率及克隆胚胎發(fā)育，但有關(guān)這些藥物對胚胎發(fā)育的作用還存在爭議。
　　為探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古菌素A(TS

2、A)處理對供體細胞的影響及其誘導供體細胞凋亡的作用機制，本研究使用不同濃度（0μM、0.05μM、0.10μM、0.20μM、0.40μM、0.80μM、1.60μM、3.20μM）TSA處理牛胎兒成纖維細胞，于處理24 h、48 h和72 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化，MTT比色法檢測細胞增殖活性的變化，流式細胞術(shù)經(jīng)PI單染法檢測細胞周期的變化，流式細胞術(shù)經(jīng)AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡的變化，Realtime

3、PCR檢測Bcl-2，Bax， Cytc，Caspase-9，Caspase-3等凋亡相關(guān)基因表達的變化，重亞硫氫酸鹽測序法檢測凋亡相關(guān)基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平的變化。主要研究結(jié)果如下:
　　1.TSA對細胞形態(tài)、增殖、細胞周期、及凋亡的影響
　　低于0.40μM的TSA處理牛胎兒成纖維細胞不影響其形態(tài)，0.40μM以上的TSA處理牛胎兒成纖維細胞時，隨TSA濃度增大、處理時間延長，脫壁的死細胞數(shù)目逐漸增加。
　　

4、TSA處理24 h、48 h和72 h后，均能抑制牛胎兒成纖維細胞的增殖活性，并具有劑量、時間依賴性。處理24 h時，細胞相對增殖率從98.64％逐漸降低到60.18％，48h時，從98.69％逐漸降低39.20％，72 h時，從96.20％逐漸降低22.47％。
　　TSA處理牛胎兒成纖維細胞24 h、48h和72 h后，均使G0/G1期細胞比例顯著增高，S期和G2/M期細胞比例顯著降低。當TSA濃度低于0.80μM時，G0/G

5、1期細胞比例隨TSA濃度增加而逐漸增高，S期和G2/M期細胞比例隨TSA濃度增加而逐漸降低;當TSA濃度高于0.80μM時，G0/G1期細胞比例又略有降低，S期和G2/M期細胞比例又有所升高。
　　TSA處理牛胎兒成纖維細胞誘導其發(fā)生凋亡。處理24 h后，早期凋亡率從4.55％逐漸升高到21.20％，晚期凋亡率從1.31％升高到6.08％，死細胞率從0.44％升高到2.93％，活細胞從93.7％逐漸降低到69.09％;處理48h和

6、72 h后，早期和晚期凋亡率進一步升高，活細胞率進一步降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　2.凋亡相關(guān)基因表達及相關(guān)基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平的變化
　　0.80μM TSA處理牛胎兒成纖維細胞24 h、48 h和72 h后，隨著TSA處理時間的延長下調(diào)了凋亡抑制基因Bcl-2的表達，相應的其調(diào)節(jié)區(qū)DNA甲基化水平在48h有所增加，24 h和72 h沒有明顯的變化。隨著TSA處理時間的延長上調(diào)了促凋亡基因Bax的表達，相應的調(diào)節(jié)