曲古抑菌素A誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、自1997年首例體細(xì)胞核移植克隆綿羊多利誕生以來，哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)得到了快速發(fā)展，但目前克隆效率低下和胚胎發(fā)育異常等仍是體細(xì)胞克隆技術(shù)所遇到的突出問題。近年來研究表明，卵母細(xì)胞胞質(zhì)對(duì)供體細(xì)胞的表觀遺傳重編程不完全與發(fā)育異常的問題引起了人們的關(guān)注。人們嘗試使用影響DNA甲基化及組蛋白修飾等藥物處理供體細(xì)胞來提高克隆效率及克隆胚胎發(fā)育，但有關(guān)這些藥物對(duì)胚胎發(fā)育的作用還存在爭(zhēng)議。
　　為探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古菌素A(TS

2、A)處理對(duì)供體細(xì)胞的影響及其誘導(dǎo)供體細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本研究使用不同濃度（0μM、0.05μM、0.10μM、0.20μM、0.40μM、0.80μM、1.60μM、3.20μM）TSA處理牛胎兒成纖維細(xì)胞，于處理24 h、48 h和72 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的變化，流式細(xì)胞術(shù)經(jīng)PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，流式細(xì)胞術(shù)經(jīng)AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，Realtime

3、PCR檢測(cè)Bcl-2，Bax， Cytc，Caspase-9，Caspase-3等凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化，重亞硫氫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平的變化。主要研究結(jié)果如下:
　　1.TSA對(duì)細(xì)胞形態(tài)、增殖、細(xì)胞周期、及凋亡的影響
　　低于0.40μM的TSA處理牛胎兒成纖維細(xì)胞不影響其形態(tài)，0.40μM以上的TSA處理牛胎兒成纖維細(xì)胞時(shí)，隨TSA濃度增大、處理時(shí)間延長，脫壁的死細(xì)胞數(shù)目逐漸增加。
　　

4、TSA處理24 h、48 h和72 h后，均能抑制牛胎兒成纖維細(xì)胞的增殖活性，并具有劑量、時(shí)間依賴性。處理24 h時(shí)，細(xì)胞相對(duì)增殖率從98.64％逐漸降低到60.18％，48h時(shí)，從98.69％逐漸降低39.20％，72 h時(shí)，從96.20％逐漸降低22.47％。
　　TSA處理牛胎兒成纖維細(xì)胞24 h、48h和72 h后，均使G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低。當(dāng)TSA濃度低于0.80μM時(shí)，G0/G

5、1期細(xì)胞比例隨TSA濃度增加而逐漸增高，S期和G2/M期細(xì)胞比例隨TSA濃度增加而逐漸降低;當(dāng)TSA濃度高于0.80μM時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例又略有降低，S期和G2/M期細(xì)胞比例又有所升高。
　　TSA處理牛胎兒成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。處理24 h后，早期凋亡率從4.55％逐漸升高到21.20％，晚期凋亡率從1.31％升高到6.08％，死細(xì)胞率從0.44％升高到2.93％，活細(xì)胞從93.7％逐漸降低到69.09％;處理48h和

6、72 h后，早期和晚期凋亡率進(jìn)一步升高，活細(xì)胞率進(jìn)一步降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　2.凋亡相關(guān)基因表達(dá)及相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平的變化
　　0.80μM TSA處理牛胎兒成纖維細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，隨著TSA處理時(shí)間的延長下調(diào)了凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，相應(yīng)的其調(diào)節(jié)區(qū)DNA甲基化水平在48h有所增加，24 h和72 h沒有明顯的變化。隨著TSA處理時(shí)間的延長上調(diào)了促凋亡基因Bax的表達(dá)，相應(yīng)的調(diào)節(jié)