鉛、鎘誘導(dǎo)東北虎成纖維細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究.pdf

1、東北虎，是世界上虎中體型最大的亞種，野生種群現(xiàn)主要分布于中國(guó)東北、俄羅斯遠(yuǎn)東和朝鮮北部。在我國(guó)，東北虎曾廣泛分布于東北各林區(qū)，20世紀(jì)初受到人類的直接獵殺和生存環(huán)境的惡化，野生種群數(shù)量銳減，分布區(qū)逐漸縮小，現(xiàn)已成為世界上最為瀕危的大型貓科動(dòng)物之一。隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)和交通的快速發(fā)展，東北虎的生境受到嚴(yán)重的威脅，尤其是環(huán)境中的重金屬鉛、鎘的污染，對(duì)東北虎的生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病的發(fā)生都會(huì)產(chǎn)生重要的影響。鉛、鎘可誘導(dǎo)各類細(xì)胞發(fā)生凋亡并對(duì)多個(gè)系統(tǒng)造成損

2、傷。
　　首先圍繞東北虎成纖維細(xì)胞展開(kāi)生物學(xué)特性研究。細(xì)胞復(fù)蘇后進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞活率、細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、同工酶酶譜分析以及熒光蛋白基因表達(dá)等細(xì)胞質(zhì)量檢測(cè)與生物學(xué)特性研究。結(jié)果顯示，東北虎成纖維細(xì)胞具有典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)特征，細(xì)胞凍存前和復(fù)蘇后的活率分別為96.34％±2.24％，93.72％±2.77％，差異不顯著(P＞0.05)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型曲線，同工酶酶譜表明該細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)室其它物種細(xì)胞不存在交叉污染。細(xì)胞具有接受外

3、源基因表達(dá)的能力。
　　前期保存的東北虎成纖維細(xì)胞系為高質(zhì)量的、符合標(biāo)準(zhǔn)的、典型的成纖維細(xì)胞，以此作為實(shí)驗(yàn)材料研究鉛、鎘對(duì)東北虎成纖維細(xì)胞的凋亡作用及其機(jī)制。
　　通過(guò)細(xì)胞毒性分析，激光共聚焦顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞顯微及亞顯微結(jié)構(gòu)變化，彗星實(shí)驗(yàn)分析DNA損傷情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞亞二倍體峰和凋亡率一系列實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，32μM，64μM，125μM，250μM濃度的Pb(Ac)2和1.2μM，2.4μM，4.8

4、μM，9.6μM濃度的CdCl2在12-48h時(shí)間內(nèi)對(duì)東北虎成纖維細(xì)胞具有一定的毒性;東北虎成纖維細(xì)胞在鉛、鎘作用下發(fā)生特征性的凋亡形態(tài)學(xué)改變，如胞質(zhì)固縮，染色質(zhì)濃縮，核膜邊緣化，線粒體腫脹，崩解等現(xiàn)象，但鉛并未對(duì)細(xì)胞骨架微絲的分布、形態(tài)結(jié)構(gòu)造成明顯的損壞，而鎘對(duì)東北虎成纖維細(xì)胞骨架微絲的分布、形態(tài)結(jié)構(gòu)造成明顯的損壞，微絲分布松散，頂端縮短、缺失;彗星實(shí)驗(yàn)表明鉛、鎘可使東北虎成纖維細(xì)胞DNA損傷，呈現(xiàn)出明顯的拖尾現(xiàn)象;亞二倍體峰和細(xì)胞凋

5、亡率檢測(cè)結(jié)果表明，鉛、鎘可誘導(dǎo)東北虎成纖維細(xì)胞出現(xiàn)明顯的二倍體峰，且表現(xiàn)出濃度依賴性，凋亡率也呈現(xiàn)出濃度依賴性。
　　通過(guò)細(xì)胞周期的測(cè)定，線粒體膜電位的檢測(cè)，胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)分析，胞內(nèi)活性氧的檢測(cè)，胞外鈣離子流速監(jiān)測(cè)，胞外鉀離子流速監(jiān)測(cè)，Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9酶活性的檢測(cè)，RT-PCR檢測(cè)等一系列實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，鉛、鎘均可使細(xì)胞增殖阻滯在G0/G1期，干擾了細(xì)胞增殖活動(dòng)從而誘導(dǎo)其凋亡;鉛、鎘可使東

6、北虎成纖維細(xì)胞線粒體跨膜電位下降，結(jié)合電子顯微鏡觀察結(jié)果可知線粒體腫脹，崩解，鉛、鎘破壞線粒體的功能，最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生;鉛、鎘可打破胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，激活鈣的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，胞內(nèi)鈣離子濃度的的增加是由于內(nèi)源性的鈣庫(kù)釋放所引起的，而非吸收胞外的鈣離子而升高的;鉛、鎘可破壞細(xì)胞氧化-抗氧化平衡，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷;鉛、鎘處理東北虎成纖維細(xì)胞凋亡早期促使了鉀離子外流，破壞胞質(zhì)滲透壓，這一研究結(jié)果為認(rèn)識(shí)鉛、鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機(jī)制提供了新的證據(jù)。鉛、

7、鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9酶活性呈上升的趨勢(shì)，呈濃度依賴性;基因Bax與Bcl-2表達(dá)量之比值隨鉛、鎘濃度增加而上升，Caspase-3，Caspase-8，F(xiàn)as，P53表達(dá)量也隨鉛、鎘濃度增大呈上升趨勢(shì)。鉛、鎘通過(guò)阻滯DNA合成，破壞線粒體的功能，干擾鈣穩(wěn)態(tài)，氧化損傷，破壞胞質(zhì)滲透壓以及基因調(diào)控，介導(dǎo)Caspase來(lái)誘導(dǎo)東北虎成纖維細(xì)胞凋亡的。
　　一定濃度的鉛、鎘在一定的作