脂多糖誘導肺成纖維細胞表型轉變及異常增殖的機制研究.pdf

1、肺纖維化是急性肺損傷（acute lung injury, ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）發(fā)展的重要病理階段，以肺成纖維細胞異常增殖、活化并分泌膠原蛋白，形成肺間質和肺泡內彌散性纖維化為特點。革蘭氏陰性桿菌細胞壁的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）可以作用于肺成纖維細胞的特異性受體—Toll樣受體4（Toll-like recept

2、or4, TLR4），并直接引起肺成纖維細胞的活化和增殖，與肺纖維化發(fā)生密切相關。然而 LPS對成纖維細胞增殖作用的研究結果很不一致，提示不同來源的成纖維細胞亞型可能因存在著不同的表型而產生異質性（heterogeneity），其可能是細胞對LPS刺激產生不同生物學效應的重要原因。
　　Thy-1是成纖維細胞表面由糖磷脂酰肌醇錨定的糖蛋白，根據細胞表面胸腺細胞分化抗原-1（thymocyte differentiation ant

3、igen1, Thy-1）表達的情況，可以將肺成纖維細胞分為Thy-1(＋)及Thy-1(－)兩種不同的表型。Thy-1在正常肺成纖維細胞表面大量表達，但是在特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）患者肺組織存在著大量Thy-1呈陰性表達的Thy-1(－)肺成纖維細胞。Thy-1(-)的肺成纖維細胞在各種致纖維化因子刺激下具有更活躍的反應能力，與肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展密切相關。有研究表明Thy

4、-1基因表達受組蛋白去乙酰化等表觀遺傳學機制的調控，也有研究表明LPS可以通過組蛋白去乙?；缺碛^遺傳學機制調控多種基因的表達。但是，目前尚未明確LPS是否通過表觀遺傳調控作用抑制肺成纖維細胞Thy-1基因的表達而改變細胞的表型，引起肺成纖維細胞的增殖。
　　本課題擬利用LPS誘導肺成纖維細胞增殖的模型，首先明確LPS直接誘導原代培養(yǎng)的Thy-1(＋)肺成纖維細胞發(fā)生表型轉變的和異常增殖的作用；隨后通過RNAi技術抑制肺成纖維細胞

5、TLR4的表達，研究LPS通過TLR4對肺成纖維細胞Thy-1基因表達以及細胞表型轉變和異常增殖的表觀遺傳學調控作用。
　　第一部分,脂多糖誘導肺成纖維細胞表型轉變的作用研究
　　目的：明確在急性肺損傷肺纖維化早期，脂多糖（LPS）誘導肺成纖維細胞增殖及表型轉變的作用。
　　方法：原代培養(yǎng)小鼠肺成纖維細胞，以終濃度為0.01μg/ml、0.1μg/ml和1μg/ml的LPS刺激細胞，并設陰性對照；LPS作用0h、6h、

6、24h、48h和72h后以CCK-8（cell counting kit-8）細胞計數試劑盒檢測細胞增殖情況，以real-time PCR檢測各組細胞Thy-1 mRNA的動態(tài)表達情況。
　　結果：原代培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細胞Thy-1基因呈陽性表達；以不同濃度LPS刺激細胞最初24小時內未見細胞明顯增殖，48-72小時后細胞增殖速率顯著增加，同時伴有Thy-1基因表達量顯著下降，經統(tǒng)計學檢驗差異存在顯著性（P<0.05）。相對于0

7、.01μg/ml和0.1μg/ml兩個濃度，以1μg/ml的LPS刺激細胞產生的細胞增殖及Thy-1基因表達下調的反應更為顯著。
　　結論：LPS可通過抑制肺成纖維細胞Thy-1基因的表達而使細胞發(fā)生表型轉變并引起異常增殖。
　　第二部分,小鼠肺成纖維細胞TLR4 siRNA序列的設計和siRNA慢病毒載體的構建
　　目的：設計、構建和鑒定TLR4-RNAi慢病毒載體（Lentivirus-TLR4-siRNA）用于后

8、續(xù)實驗。
　　方法：設計、制備3個針對TLR4基因的siRNA質粒并進行慢病毒包裝。轉染原代培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細胞后通過Real-time PCR篩選RNA干擾最佳靶點。
　　結果：經PCR鑒定和測序驗證，成功構建了3個針對的TLR4基因的siRNA質粒并進行慢病毒包裝，形成TLR4- RNAi慢病毒載體（Lentivirus-TLR4-siRNA）；經Real-time PCR篩選出最佳TLR4-RNAi慢病毒載體（Tar

9、get2＃），其病毒滴度測定結果為8×107TU/ml，抑制效率約80%。
　　結論：針對TLR4基因的Lentivirus-TLR4-siRNA能有效抑制原代培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細胞TLR4基因的表達，用于后續(xù)實驗。
　　第三部分,脂多糖調控Thy-1(＋)肺成纖維細胞表型轉變及異常增殖的機制
　　目的：明確脂多糖調控Thy-1(＋)肺成纖維細胞表型轉變及異常增殖的機制。
　　方法：利用LPS誘導肺成纖維細胞增殖

10、模型，首先觀察 LPS刺激原代培養(yǎng)的Thy-1(＋)肺成纖維細胞0-72小時細胞增殖及Thy-1基因表達的動態(tài)變化過程。隨后深入研究LPS誘導Thy-1(＋)肺成纖維細胞表型轉變的表觀遺傳學機制，重點探討LPS通過TLR4的活化對肺成纖維細胞Thy-1基因啟動區(qū)組蛋白乙?；揭约凹毎鸗hy-1基因表達的影響，并嘗試通過RNAi技術抑制肺成纖維細胞TLR4的表達從而抑制由LPS引起的Thy-1基因沉默現象。
　　結果：BrdU檢測

11、發(fā)現：以1μg/ml濃度 LPS刺激細胞最初24小時內未見細胞明顯增殖，48-72小時后細胞增殖速率顯著增加。
　　real-time PCR及Western-blot檢測發(fā)現：原代培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細胞Thy-1基因呈陽性表達；以LPS刺激細胞最初24小時內Thy-1基因及蛋白表達量開始下降；LPS刺激48-72小時后Thy-1基因及蛋白表達量顯著下降。
　　real-time PCR及Western-blot檢測發(fā)現：以

12、LPS刺激肺成纖維細胞72小時可引起細胞Thy-1基因及蛋白表達量顯著下降，但是細胞在轉染TLR4 siRNA慢病毒載體抑制TLR4表達后，以上過程被抑制。
　　Western-blot檢測發(fā)現：以LPS刺激肺成纖維細胞72小時可引起細胞乙?；M蛋白H3及H4（Ace-H3, Ace-H4）表達量顯著下降，提示組蛋白乙酰化程度降低。但是細胞在轉染TLR4 siRNA慢病毒載體抑制TLR4表達后，以上過程被抑制。
　　結論：L