DAPT對肺成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化中Wnt信號通路影響研究.pdf

1、目的:
　　研究γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號通路后，Wnt信號通路中的wnt1、β-catenin及肌成纖維細胞標(biāo)志因子α-SMA的表達變化，探討Wnt/β-catenin信號通路與Notch信號通路之間存在直接或間接的相互作用以及Wnt/β-catenin信號通路在DAPT抑制肺成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化中的作用表達。
　　方法:
　　(1)從出生2-3天SD大鼠的幼鼠中取得肺組織，采用胰酶消化法分離培養(yǎng)出肺成

2、纖維細胞，并使用波形蛋白(Vimentin)免疫細胞化學(xué)方法檢測培養(yǎng)至第三代肺成纖維細胞的純度;(2)予無血清的DMEM培養(yǎng)基同步培養(yǎng)細胞24h，并將其分為對照組、TGF-β1組、TGF-β1+DAPT組;(3)分別在TGF-β1組和TGF-β1+DAPT組中加入5ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，并在TGF-β1+DAPT組中加入500nmol/L的DAPT抑制纖維細胞增殖，并作用于肺成纖維細胞24h，觀察其形

3、態(tài)學(xué)改變;(4)分別采用RT-PCR法檢測α-SMA、wnt1及β-catenin的mRNA表達變化，Western blot法檢測β-catenin的蛋白表達變化;(5)采用SPASS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗，多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。
　　結(jié)果:
　　(1) Vimentin免疫細胞化學(xué)檢測:幾乎所有第三代細胞胞質(zhì)內(nèi)均可見棕黃色顆粒，證明使用胰酶

4、消化至第三代細胞幾乎全為肺成纖維細胞;(2)α-SMAmRNA表達:對照組α-SMA mRNA值(0.385±0.015)、TGF-β1組（0.615±0.025）、TGF-β1+DAPT組(0.345±0.027)，其中TGF-β1組α-SMA mRNA值較對照組和TGF-β1+DAPT組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，但對照組較TGF-β1+DAPT組無明顯差異，即差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05);(3) wnt1 mR

5、NA值表達:對照組wnt1 mRNA值（0.233±0.005）、TGF-β1組（0.257±0.010）、TGF-β1+DAPT組（0.209±0.016），可知TGF-β1組wnt1 mRNA值較對照組和TGF-β1+DAPT組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);(4)β-catenin mRNA和蛋白表達:對照組β-catenin mRNA和蛋白相對吸光光度值（0.984±0.031和0.352±0.023）、TGF-β1

6、組（1.248±0.021和0.431±0.014）、TGF-β1+DAPT組（0.895±0.056和0.102±0.024），可見TGF-β1組較對照組和TGF-β1+DAPT組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1) TGF-β1可誘導(dǎo)肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，在轉(zhuǎn)化過程中α-SMA、β-catenin、wnt1表達增高;(2) DAPT阻斷Notch信號通路后，影響了成纖維細胞表型轉(zhuǎn)