IL-32γ促人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1增殖、活化機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　慢性氣道炎癥性疾病，如慢性阻塞性肺疾?。–hronicObstructivePulmonaryDisease，COPD）、支氣管哮喘等是由多種細(xì)胞（如：T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞）和細(xì)胞組分參與的慢性非特異性疾病[1，2，3]。其主要的病理特點是彌散性氣道、肺實質(zhì)以及肺泡的慢性炎癥和結(jié)構(gòu)破壞[1]，最終導(dǎo)致氣管管腔狹窄和進(jìn)行性氣道阻力增加，此過程稱為氣道重

2、塑。人肺成纖維細(xì)胞是人類氣道黏膜下主要的結(jié)構(gòu)細(xì)胞之一，在多種炎癥因子的刺激下，肺成纖維細(xì)胞可轉(zhuǎn)化成分泌膠原及細(xì)胞外基質(zhì)能力更強(qiáng)的肺肌成纖維細(xì)胞[55]。人肺成纖維細(xì)胞在氣道重塑過程中數(shù)量與活性均顯著增加，所產(chǎn)生的膠原等細(xì)胞外基質(zhì)亦顯著增多，過度表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì)在氣道壁大量沉積，不僅導(dǎo)致氣道壁增厚、僵硬、順應(yīng)性下降，還可活化炎癥細(xì)胞或抑制炎癥細(xì)胞凋亡[4，5，6]。
　　白細(xì)胞介素-32（Interleukin-32，IL-32）是

3、一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，基因定位于人類16號染色體P13.3位點，包含8個外顯子和6種亞型，包括IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε和IL-32ζ[2，6，7]，其中以IL-32γ亞型的生物活性最高[8，9，10]。IL-32是一種涉及多種生物功能的細(xì)胞因子，包括細(xì)胞分化、誘導(dǎo)促炎癥因子與抗炎癥因子表達(dá)、誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡等[2，6，7，11]。有研究顯示氣道慢性炎癥疾病中，人肺成纖維細(xì)胞的IL-32表達(dá)水

4、平增高，由此可見IL-32與氣道重塑密切相關(guān)。
　　整合素（Integrins）是一種細(xì)胞表面受體，由18種α和8種β亞單位組成的異二聚體，其中各亞基均包含一個細(xì)胞外域、跨膜域以及細(xì)胞質(zhì)域，其表達(dá)于不同的細(xì)胞表面，參與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的信號傳遞[12，13]，信號通過細(xì)胞膜傳遞活化細(xì)胞內(nèi)的激酶，如局部粘著斑激酶（FocalAdhesionKinase，F(xiàn)AK），活化后的局部粘著斑激酶繼而活化下游的信號傳導(dǎo)分子，在細(xì)胞增生、遷移

5、、粘附、存活以及凋亡等方面發(fā)揮重要作用[13，14，15]。最新的研究證實整合素在正常肺組織低表達(dá)，在呼吸道疾病患者的肺組織中表達(dá)明顯升高[13]，也有研究顯示敲除整合素αvβ6基因可減緩氣道重塑[23]，可見IL-32、整合素、人肺成纖維細(xì)胞在氣道重塑中關(guān)系密切。
　　有研究顯示，整合素細(xì)胞外域能與含RGD氨基酸序列信號分子結(jié)合，使整合素發(fā)生簇集，細(xì)胞外域構(gòu)象發(fā)生改變，引起跨膜域和細(xì)胞內(nèi)域構(gòu)象改變，整合素α亞基和β亞基之間的鹽鍵

6、破壞，β亞基暴露，局部粘著斑激酶的活化，繼而活化下游信號傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞增生、遷移、粘附、存活以及凋亡等方面發(fā)揮重要作用[13，14，15]，國外有研究證實IL-32含RGD氨基酸序列[16]。為此，我們猜想IL-32γ可能通過RGD氨基酸序列與整合素結(jié)合，并發(fā)揮其生物效應(yīng)。
　　近年來國內(nèi)外大量研究證實了IL-32與氣道重塑的密切相關(guān)，但絕大部分僅論述了慢性氣道炎癥、氣道重塑患者的血清、肺泡灌洗液、痰液、肺組織中的IL-32較健

7、康對照組升高，但未能解釋IL-32在氣道重塑過程中的機(jī)制。本文旨在研究IL-32γ對人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1增殖、活化和對整合素-局部黏著斑激酶通路的影響，初步解釋IL-32促人肺胚胎成纖維細(xì)胞增殖、活化的機(jī)制。
　　研究目的：
　　本課題旨在研究IL-32γ對人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1增殖、活化的影響和研究IL-32γ對整合素-局部黏著斑激酶通路的影響，初步解釋IL-3γ2促人肺胚胎成纖維細(xì)胞增殖、活化的機(jī)制。
　　方法：

8、
　　1.人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.把人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1按5×103/孔或7.5×103/孔接種于96孔板里孵育6小時，待人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1貼壁后，吸凈培養(yǎng)液，隨后加入含不同濃度（0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml）的IL-32γ蛋白的培養(yǎng)液。IL-32γ蛋白與人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1共同培養(yǎng)2

9、4小時后（37℃、5%CO2培養(yǎng)箱），每孔加入10μlCCK-8，再置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時后，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度，并記錄數(shù)據(jù)。
　　3.將人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1按1×106/孔置于6孔板中孵育24小時，細(xì)胞貼壁后，吸凈培養(yǎng)液，高溫滅菌的PBS緩沖液沖洗，隨后加入含四個不同濃度（0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml）IL-32γ蛋白的培養(yǎng)液。IL-32γ蛋白與人肺胚胎成纖維細(xì)胞

10、-1共同培養(yǎng)72小時后（37℃、5%CO2培養(yǎng)箱），再通過蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）檢測不同濃度IL-32γ刺激下collagen-1和α-SMA兩種蛋白的表達(dá)水平，以此反映人肺胚胎成纖維細(xì)胞活化水平。
　　4.將人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1按1×106/孔置于6孔板中孵育24小時，細(xì)胞貼壁后，吸凈培養(yǎng)液，高溫滅菌的PBS緩沖液沖洗，隨后加入含不同濃度（0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml）IL-32γ

11、蛋白的培養(yǎng)液。IL-32γ蛋白與人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1共培養(yǎng)72小時（37℃、5%CO2培養(yǎng)箱），然后提取細(xì)胞總RNA，通過實時熒光定量PCR方法檢測整合素αv、整合素β3、整合素β6及局部黏著斑激酶的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組相比（含0ng/ml的IL-32γ蛋白組），人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1與IL-32γ共同培養(yǎng)后，其在450nm處的吸光度明顯增高（p<0.001），并與IL-32γ濃度呈正相關(guān)（r=0.91

12、3，p<0.05）。
　　2.與對照組相比（含0ng/ml的IL-32γ蛋白組），人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1與IL-32γ共同培養(yǎng)后，其Collagen-1蛋白和α-SMA蛋白表達(dá)水平升高。
　　3.與對照組相比（含0ng/ml的IL-32γ蛋白組），人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1與IL-32γ共同培養(yǎng)后，其表達(dá)整合素αv、整合素β3、整合素β6mRNA的RQ值升高（p<0.05），且與IL-32γ蛋白的濃度呈正相關(guān)（r=0.888，p

13、<0.01；r=0.924，p<0.01；r=0.947，p<0.01）。
　　4.與對照組相比（含0ng/ml的IL-32γ蛋白組），人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1與IL-32γ共同培養(yǎng)后，其表達(dá)局部粘著斑激酶mRNA的RQ明顯升高，與IL-32γ蛋白濃度呈正相關(guān)（r=0.762，p<0.01）。
　　5.在不同濃度IL-32γ影響下，局部黏著斑激酶RQ值的變化與整合素αv、整合素β3、整合素β6RQ值的變化呈正相關(guān)（r=0.72

14、4，p<0.01；r=0.846，p<0.01；r=0.796，p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml濃度的IL-32γ可促進(jìn)人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1的增殖、活化；
　　2.5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml濃度的IL-32γ可促進(jìn)人肺胚胎成纖維細(xì)胞-1整合素αv、整合素β3、整合素β6、局部黏著斑激酶的mRNA表達(dá)；
　　3.IL-32γ可能通過整合素-局部黏