凝血酶促人肺成纖維細胞增殖及其機制的研究.pdf

1、背景：各種急慢性呼吸系統(tǒng)疾病常存在病原體感染、內毒素產生、炎性介質和炎性因子釋放、缺氧、缺血、酸中毒等諸多因素中的一種或多種，這些因素可導致血管內皮受損和組織因子釋放，激活各種凝血因子，使血液呈高凝狀態(tài)或(和)血栓形成。凝血酶是參與此過程中的重要凝血因子之一。已有研究資料證實，除發(fā)揮凝血功能外，凝血酶還具有重要的非凝血功能，即通過與細胞膜表面的蛋白酶激活受體-1(PAR1)結合，激活一系列下游信號通路，在細胞的生長、增殖、分泌，粘附等方

2、面發(fā)揮重要作用。在急性肺損傷和各種慢性肺部疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)、肺間質性疾病中，肺泡灌洗液中的凝血酶濃度顯著升高，其與PAR1結合，產生各種病理生理作用，如促進各類炎癥因子IL-6、IL-8、PGE2、GM-CSF的釋放，調控肺部的炎癥反應及修復增殖。另有研究表明凝血酶可通過激活NADPH氧化酶亞單位p47(phox)和p67(phox)誘導多種細胞如血管平滑肌細胞、血管內皮細胞、海馬神經元細胞等產生以活性氧(ROS)為主的

3、自由基。ROS對細胞的作用具有兩面性，一方面，高濃度下具有損傷作用，參與促進細胞的凋亡、壞死過程；另一方面，低濃度可作為重要的信號分子，參與細胞信號轉導，主要激活MAPK通路，通過激活轉錄因子，影響基因的表達，促進細胞增殖、分化等。核因子NF-κ B是重要的轉錄因子之一，在氧化應激、感染、炎癥反應、細胞凋亡及異常增殖等病理過程中，因調節(jié)多種靶基因的表達而發(fā)揮重要作用。肺成纖維細胞是肺組織重要結構細胞，占肺間質全部常駐細胞的95％以上，也

4、是參與肺損傷修復的主要細胞。在損傷后的修復過程中，成纖維細胞表現出極高增殖反應。各種損害因子導致肺部毛細血管通透性增加，血漿成分滲漏到毛細血管外并與肺成纖維細胞接觸，刺激該細胞的增殖修復反應。推測凝血酶可能在其中發(fā)揮一定作用。
　　 目的：凝血酶作用于肺成纖維細胞，檢測細胞產生ROS情況及產生途徑，觀察ROS是否可以活化MAPK信號系統(tǒng)，進而影響核轉錄因子NF-κ B，調控生長基因的表達。
　　 方法：選擇人肺成纖維細胞

5、(HLF)作為體外研究對象，一定濃度的凝血酶作用于該細胞。MTT法和流式細胞Brdu摻入法檢測凝血酶促人肺成纖維細胞增殖現象；利用化學熒光法、流式細胞檢測技術和GSH檢測試劑盒檢測活性氧的產生；Western blot法檢測PAR1，NADPH氧化酶、ERK1/2及p38MAPK信號蛋白的表達；激光共聚焦顯微掃描技術觀察NF-κ B中亞單位p65向核內轉移情況。
　　 結果：⑴在0.1U/ml-20U/ml濃度范圍內，凝血酶對細

6、胞的增殖能力隨濃度遞增而增強。在10 U/ml及以上時，與對照組比較，可顯著促進HLF細胞的增殖(P<0.05)，但當濃度超過20U/ml，增殖作用不再增強；20 U/ml的凝血酶分別作用HLF24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，從36h時間點開始，與對照組比較，凝血酶組細胞增殖能力顯著增強(P<0.05)；BrdU摻入增殖實驗結果顯示，凝血酶濃度在10 U/ml及以上時，較對照組可顯著促進HLF細胞增殖(P<0.05)，

7、并隨濃度增加而增強，但當凝血酶濃度超過20U/ml，增殖作用不再更強。⑵5U/ml及以上濃度的凝血酶可顯著增加HLF內的活性氧數量(P<0.05)，并呈劑量依賴關系，但當濃度大于20U/ml，活性氧的量不再增加；20U/ml凝血酶作用HLF細胞30min，流式檢測顯示細胞內ROS產生量較對照組增加64.7％，作用1h時細胞內ROS量較對照組增加138.8％，而加入凝血酶拮抗劑水蛭素組細胞內ROS量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.

8、05)；10U/ml和20 U/ml的凝血酶作用HLF細胞，細胞內GSH/GSSG比值較對照組顯著降低(P<0.05)，而加入水蛭素或氧自由基拮抗劑NAC組，GSH/GSSG之比與對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。⑶20 U/ml凝血酶作用于HLF細胞10min和30min，胞漿內NADPH氧化酶亞單位p47phox和Rac2表達顯著降低(P<0.05)，1h后幾乎無蛋白表達。加入水蛭素組與對照組比較，p47phox和Rac2表達無統(tǒng)

9、計學意義(P>0.05)。⑷凝血酶作用于HLF細胞10min到2h，細胞內磷酸化ERK1/2表達水平較對照組顯著升高(P<0.05)，而提前加入NAC或水蛭素組則無表達；細胞內p38MAPK磷酸化不受凝血酶影響，即凝血酶作用HLF細胞10min到2h，蛋白磷酸化水平較對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。⑸凝血酶分別作用HLF細胞5min、10min、30min、1h和2h，各時間點細胞核內代表p65的熒光含量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意

10、義(P>0.05)，而佛波酯組熒光含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。⑹支氣管上皮細胞和肺成纖維細胞均有PAR1蛋白表達，肺成纖維細胞受體表達更明顯(P<0.05)。
　　 結論：①凝血酶具有促進人肺成纖維細胞HLF增殖的能力。②凝血酶促進HLF細胞增殖機制包括如下。③凝血酶受體PAR1在HLF中有較高表達。④凝血酶通過與PAR1受體結合，激活NADPH氧化酶，誘導細胞產生活性氧。⑤凝血酶通過磷酸化ERK1/2而不是