截短β連環(huán)素對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、本文擬利用基因轉(zhuǎn)染、RT-PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)和蛋白印跡(WesternBlotting，WB)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)探討β-catenin對(duì)成纖維細(xì)胞有何作用及作用機(jī)制。 研究方法： 利用eDNA文庫(kù)經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得人截短beta catenin基因，構(gòu)建質(zhì)粒SCAT-pcDNA3.0：利用Sofast轉(zhuǎn)染試劑將SCAT-pcDNA3.0質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)，

2、收集細(xì)胞分別在mRNA和蛋白水平觀察如下指標(biāo)：游走性，膠原Ⅰ、Ⅲ合成量，β平滑肌肌動(dòng)蛋白、上皮鈣粘連蛋白、 MMP-7合成狀態(tài)。結(jié)果分析以電泳條帶上灰度值作為表達(dá)產(chǎn)物水平的參數(shù)。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著檢驗(yàn)水準(zhǔn)α值取0.05。 研究結(jié)果： 用KpnⅠ和Xho Ⅰ雙酶切PCR產(chǎn)物并回收該片段。將該片段連接到同樣被Kpn I和XhoⅠ雙酶切的pcDNA3.0載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感

3、受態(tài)細(xì)菌，挑取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，進(jìn)行酶切鑒定，并獲得陽性克隆。重組質(zhì)粒測(cè)序分析結(jié)果與Genebank內(nèi)β-catenin序列比較，結(jié)果表明沒有錯(cuò)配。 使用轉(zhuǎn)染試劑Sofast將構(gòu)建成功表達(dá)質(zhì)粒、pcDNA3.0質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染入人胚肺成纖維細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察對(duì)照組出現(xiàn)綠色熒光。RT-PCR及Western Blot檢測(cè)β-catenin及新霉素抗性基因表達(dá)顯示：正常細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞有少量β-ca

4、tenin表達(dá)，而轉(zhuǎn)染SCAT-pcDNA3.0質(zhì)粒的HELF細(xì)胞有強(qiáng)烈的β-eatenin表達(dá)；新霉素抗性基因在HELF細(xì)胞中無表達(dá)，但在轉(zhuǎn)染空載體和轉(zhuǎn)染SCAT-pcDNA3.0質(zhì)粒的HELF細(xì)胞中有較強(qiáng)的表達(dá)。 轉(zhuǎn)染SCAT-pcDNA3.0HELF細(xì)胞合成膠原Ⅰ較HELF細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞增加，而膠原Ⅲ的合成在轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞及HELF細(xì)胞有較小區(qū)別，但在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞中有較高表達(dá)。Wnt/β-catenin下游基因M

5、MP-7(matrix metal loproteinas7/matrilysin，MMP-7)，cyclin D1表達(dá)增加，MMP-9(matrix metalloproteinas 9)表達(dá)沒有變化。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒HELF細(xì)胞合成a-SMA(a平滑肌蛋白，a-SMA)增加，但E-cadherin(上皮型鈣粘連素，E-cadherin)合成明顯減少。轉(zhuǎn)染SCAT-pcDNA3.0細(xì)胞游走性明顯增加。 研究結(jié)論： 1．β-