截短β連環(huán)素對人胚肺成纖維細胞的作用及機制的研究.pdf

1、本文擬利用基因轉染、RT-PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)和蛋白印跡(WesternBlotting，WB)等實驗技術探討β-catenin對成纖維細胞有何作用及作用機制。 研究方法： 利用eDNA文庫經(jīng)PCR擴增獲得人截短beta catenin基因，構建質(zhì)粒SCAT-pcDNA3.0：利用Sofast轉染試劑將SCAT-pcDNA3.0質(zhì)粒轉染入人胚肺成纖維細胞(HELF)，

2、收集細胞分別在mRNA和蛋白水平觀察如下指標：游走性，膠原Ⅰ、Ⅲ合成量，β平滑肌肌動蛋白、上皮鈣粘連蛋白、 MMP-7合成狀態(tài)。結果分析以電泳條帶上灰度值作為表達產(chǎn)物水平的參數(shù)。應用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。顯著檢驗水準α值取0.05。 研究結果： 用KpnⅠ和Xho Ⅰ雙酶切PCR產(chǎn)物并回收該片段。將該片段連接到同樣被Kpn I和XhoⅠ雙酶切的pcDNA3.0載體中，轉化大腸桿菌DH5 α感

3、受態(tài)細菌，挑取陽性克隆進行質(zhì)粒提取，進行酶切鑒定，并獲得陽性克隆。重組質(zhì)粒測序分析結果與Genebank內(nèi)β-catenin序列比較，結果表明沒有錯配。 使用轉染試劑Sofast將構建成功表達質(zhì)粒、pcDNA3.0質(zhì)粒及對照質(zhì)粒pEGFP-N1轉染入人胚肺成纖維細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察對照組出現(xiàn)綠色熒光。RT-PCR及Western Blot檢測β-catenin及新霉素抗性基因表達顯示：正常細胞及轉染空質(zhì)粒細胞有少量β-ca

4、tenin表達，而轉染SCAT-pcDNA3.0質(zhì)粒的HELF細胞有強烈的β-eatenin表達；新霉素抗性基因在HELF細胞中無表達，但在轉染空載體和轉染SCAT-pcDNA3.0質(zhì)粒的HELF細胞中有較強的表達。 轉染SCAT-pcDNA3.0HELF細胞合成膠原Ⅰ較HELF細胞及轉染空載體細胞增加，而膠原Ⅲ的合成在轉染空載體細胞及HELF細胞有較小區(qū)別，但在轉染重組質(zhì)粒細胞中有較高表達。Wnt/β-catenin下游基因M

5、MP-7(matrix metal loproteinas7/matrilysin，MMP-7)，cyclin D1表達增加，MMP-9(matrix metalloproteinas 9)表達沒有變化。轉染重組質(zhì)粒HELF細胞合成a-SMA(a平滑肌蛋白，a-SMA)增加，但E-cadherin(上皮型鈣粘連素，E-cadherin)合成明顯減少。轉染SCAT-pcDNA3.0細胞游走性明顯增加。 研究結論： 1．β-