γ干擾素聯合甲強龍對人胚肺成纖維細胞的影響.pdf

1、目的：觀察γ干擾素(IFN-γ)聯合甲強龍(M-pred)對人胚肺成纖維細胞(HELF)增殖、膠原合成及轉化生長因子β1(TGF-β1)蛋白與mRNA表達的影響，旨在通過研究IFN-γ與M-pred聯合應用的體外實驗探討兩藥聯合應用對肺間質性疾病的治療效果，為臨床治療提供理論依據。 方法：將HELF于37℃，5％CO2，飽和濕度條件下，含10％新生牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml的RPMI1640培養(yǎng)液中傳代

2、培養(yǎng)，待細胞進入對數生長期后進行實驗操作。采用2×4析因設計法進行實驗設計，按M-pred(0，15μg/ml)和IFN-γ(0，250，500，750U/ml)分為A～H8個組，A組：M-pred0μg/ml+IFN-γ0U/ml，即對照組；B組：M-pred15μg/ml，即M-pred單獨應用組；C～E組為不同濃度IFN-γ單獨應用組，分別為：IFN-γ250U/ml、500U/ml、750U/ml；F～H組為M-pred與不同濃

3、度IFN-γ聯合應用組，分別為：M-pred15μg/ml+IFN-γ250U/ml，M-pred15μg/ml+IFN-γ500U/ml，M-pred15μg/ml+IFN-γ750U/ml。藥物作用于HELF48h后，進行以下實驗： 1.應用噻唑藍(MTT)法觀察HELF的抑制率：將細胞以1×105/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板，加入藥物，經MTT處理，二甲基亞楓終止反應。分別測定各組570nm波長處吸光值(A值)，計算細胞

4、抑制率。 2.免疫細胞化學方法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)表達情況：細胞爬片，加入藥物作用48h后，經過固定，抗原修復，封閉內源性過氧化物酶，及非特異性抗原結合位點后，加入一抗，小鼠抗人增殖細胞核抗原單克隆抗體(用PBS代替一抗作為陰性對照)；二抗，生物素化的山羊抗鼠IgG抗體，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光鏡下每組隨機觀察10個視野，計數細胞總數，并計數陽性細胞數，分別計算各組細胞表

5、達陽性比率。圖象分析系統(tǒng)處理，計算各組陽性細胞平均光密度值。 3.用堿水解法測定培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量代表HELF膠原合成變化：分別收取各組培養(yǎng)液0.5ml，按羥脯氨酸試劑盒操作說明處理后，測定各組550nm波長處吸光值，計算羥脯氨酸含量。 4.半定量逆轉錄—聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測TGF-β1mRNA表達變化：用Trizol法提取細胞總RNA，采用隨機引物、AMV逆轉錄酶合成cDNA，擴增產物在1.5％瓊脂糖凝

6、膠上進行電泳，EB染色，應用讀膠儀讀取各擴增條帶的積分光密度值(IOD)，以目標基因與β-actin擴增產物的積分光密度值的比值計算相對表達水平。 5.用Western印跡技術觀察TGF-β1蛋白表達情況：每組樣本收集細胞1×108個，PBS洗滌后，裂解，提取細胞胞漿蛋白?？捡R斯亮蘭測定蛋白濃度。每梳孔加100μg樣品蛋白。經凝膠電泳后轉至PVDF膜上。封閉1h，加入第一抗體，4℃過夜。加入第二二抗體，孵育1h，利用化學發(fā)光法進

7、行顯色反應，數字圖像分析系統(tǒng)照相并讀取各條帶的積分光密度值(IOD)。 以上結果應用SPSS12.0統(tǒng)計軟件分析，對數據進行析因設計的方差分析，取p＜0.05為有統(tǒng)計學意義。 結論：M-pred及IFN-γ均可抑制HELF增殖，具有降低其膠原合成及TGF-β1蛋白與mRNA表達作用；兩藥聯合應用具有協同作用，對膠原合成及TGF-β1蛋白與mRNA表達的抑制作用隨IFN-γ濃度增加而增強。IFN-γ與M-pred聯合應用治