人外周血單個核細(xì)胞及內(nèi)皮素-1對人牙周膜成纖維細(xì)胞的作用及其機制的研究.pdf

1、正畸牙齒移動是以機械力介導(dǎo)下的牙周組織改建為基礎(chǔ)的，其中牙周膜血管在正畸牙周組織改建中發(fā)揮著重要作用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者從組織學(xué)水平，采用形態(tài)學(xué)方法、生理學(xué)方法及生物化學(xué)方法觀察了正畸牙周組織變化過程中，牙周膜內(nèi)血管形態(tài)和數(shù)量及血流量的改變。研究表明：在正畸過程中，牙周組織受到壓力或張力后，會發(fā)生不同的反應(yīng)。骨吸收與局部血管增生、血循環(huán)量增加相一致；局部組織供血量增加，提高了氧含量，還可以促使干細(xì)胞向成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分化，有利于新骨形成。

2、牙周膜微循環(huán)狀態(tài)的改變能夠直接反映牙周組織功能狀態(tài)的好壞，是牙周膜纖維更新和骨改建的主要介質(zhì)。 同時，人牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周膜中最重要的功能細(xì)胞，是一類具有多種不同功能和分化潛能的細(xì)胞，其增殖與分化能力的大小對牙周組織再生起重要作用。 但是，正畸過程中牙周膜微血管的變化是否影響人牙周膜成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性，是如何具體參與正畸牙齒移動的機制，至今尚不清楚?？紤]到正畸過程中牙周膜血管變化必然會引起牙周膜血管中主要細(xì)胞成分

3、如外周血單個核細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的改變。因而，本研究通過建立人外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)與人牙周膜成纖維細(xì)胞(humanperiodontalligamentfibroblastcells，HPLFs)的共培養(yǎng)系統(tǒng)，首次探討了人PBMCs對HPLFs增殖和分化的影響，同時探討由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的內(nèi)皮素-1對HPLFs生物學(xué)特性的影響，并且深入探討其生物學(xué)機制。以期更好地

4、揭示正畸牙齒移動過程中牙周膜微循環(huán)在牙周組織改建過程中可能發(fā)揮的作用，為進一步探討正畸牙齒移動的生物學(xué)機制奠定了基礎(chǔ)。研究內(nèi)容如下： 1.正畸牙齒移動牙周膜血管變化的實驗研究 目的：通過定性和定量的方法研究正畸牙齒移動牙周膜(PDL)血管變化的規(guī)律。 方法：21只SD大鼠隨機分成7組，建立大鼠正畸牙移動模型。光鏡下觀察大鼠正畸牙PDL血管的形態(tài)和分布特征。采用組織學(xué)切片染色的方法研究PDL血管數(shù)目的變化。結(jié)果：壓

5、力側(cè)和張力側(cè)PDL血管變化規(guī)律不同。壓力側(cè)PDL血管數(shù)目高峰在受力后第7天出現(xiàn)，為28±4.9個/mm2，而張力側(cè)PDL血管密度高峰在受力后第14天出現(xiàn)，為29±3.7個/mm2。結(jié)論：在正畸力作用下，牙齒壓力側(cè)和張力側(cè)PDL血管發(fā)生一系列變化，變化規(guī)律與牙周組織骨改建周期一致。 2.外周血單個核細(xì)胞對人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖和分化的影響目的：觀察人外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，

6、PBMCs)對人牙周膜成纖維細(xì)胞(humanperiodontalligamentfibroblastcells，HPLFs)增殖分化的影響，為進一步探討正畸牙齒移動的生物學(xué)機制奠定基礎(chǔ)。方法：采用HPLFs及人PBMCs體外培養(yǎng)技術(shù)，建立二者的transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，通過細(xì)胞計數(shù)、PCNA標(biāo)記指數(shù)(labellingindex，LI)及生化檢測法觀察人外周血單個核細(xì)胞對人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖和分化的影響。結(jié)果：細(xì)胞計數(shù)結(jié)果表明，

7、3d和5d時，transwell共培養(yǎng)組HPLFs細(xì)胞計數(shù)分別為4.5×104及8.5×104，明顯高于對照組(P＜0.05)。PCNA標(biāo)記指數(shù)結(jié)果表明，共培養(yǎng)組PCNALI為8.1％±8.25％，而對照組為2.3％±2.6％，兩者之間差異顯著(P＜0.05)。同時結(jié)果顯示，transwell共培養(yǎng)組HPLFs分泌型ALP活性低于對照組。在3d時，兩組HPLFs分泌型ALP活性有顯著性差異(P＜0.05)，5d及7d時差異尤其顯著(P＜

8、0.01)。結(jié)論：人PBMCs能促進HPLFs的增殖，但抑制HPLFs分泌型ALP活性。 3.內(nèi)皮素-1對人牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖和分化的影響 目的：探討內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)對HPLFs的增殖和分化的影響，進一步闡明牙周膜微血管在正畸牙齒移動中所發(fā)揮的生物學(xué)作用。方法：采用HPLFs體外培養(yǎng)技術(shù)，通過四唑鹽(MTT)顯色分光光度法觀察ET-1對HPLFs增殖和分化影響的劑量依賴性及時間依賴性。

9、采用生化檢測法觀察ET-1對HPLFs分化的影響。結(jié)果：MTT結(jié)果表明，與對照組相比，10-8mol/l組ET-1對HPLFs具有顯著的促增殖作用(P＜0.01)，10-6mol/l組ET-1對HPLFs的增殖具有明顯的抑制作用(P＜0.01)。10-8mol/lET-1對HPLFs的增殖作用有時間依賴性。10-9mol/l～10-6mol/lET-1對HPLFs的ALP活性均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：ET-1為促HPLFs增殖的生長因子，但

10、是對其分化并不產(chǎn)生影響，可能在正畸過程中牙周組織的改建中發(fā)揮作用。 4.內(nèi)皮素-1對人牙周膜成纖維細(xì)胞cyclinD1表達(dá)的影響目的：探討ET-1對體外培養(yǎng)的HPLFs的細(xì)胞周期和cyclinD1表達(dá)的影響，進一步探討ET-1促HPLFs增殖作用的分子機制。方法：以體外培養(yǎng)的HPLFs為研究對象，通過流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)觀察ET-1對離體培養(yǎng)HPLFs的DNA合成和細(xì)胞周期的影響。采用westernblotting、RT-PC

11、R檢測10-8mol/lET-1處理3，5，7天HPLFs的cyclinD1表達(dá)的變化。結(jié)果：FCM結(jié)果表明，經(jīng)10-8mol/lET-1作用后，實驗組HPLFs的DNA合成前期(G1)細(xì)胞所占百分比有所降低，而DNA合成期(S)細(xì)胞所占百分比有所增高。反映細(xì)胞增殖活力的增殖指數(shù)PrI值也相應(yīng)有明顯提高。10-8mol/lET-1促進HPLFs的cyclinD1mRNA和蛋白的表達(dá)，且呈時間依賴性。結(jié)論：ET-1通過上調(diào)HPLFscyc