人牙周膜細胞與牙齦成纖維細胞生物學(xué)活性的實驗研究.pdf

1、目的：牙周組織包括牙齦、牙周膜及礦化組織牙骨質(zhì)和牙槽骨，主要作用是支持穩(wěn)固牙齒。由于其組成的多樣性，使牙周組織愈合比一般的軟組織愈合更為復(fù)雜。成纖維細胞是牙齦結(jié)締組織和牙周膜的主要細胞類型，在牙周組織的形成與再生、完整性的維持及功能的實施中起重要作用。有研究認(rèn)為牙周膜細胞(periodontalligament cells，PDLCs)和牙齦成纖維細胞(gingival fibroblasts，GFs)雖然在光鏡下與掃描電鏡下觀察其在形

2、態(tài)上沒有區(qū)別，但在功能上具有明顯的差異：牙齦成纖維細胞主要與牙齦組織的自身穩(wěn)定有關(guān)，而牙周膜細胞除維持自身的穩(wěn)定外，還可分化成成骨細胞和成牙骨質(zhì)細胞參與鄰近牙槽骨和牙骨質(zhì)的改建及修復(fù)再生。目前尚缺乏明確的區(qū)別牙周膜細胞和牙齦成纖維細胞的細胞標(biāo)志物。 牙周病是人類常見病、多發(fā)病，發(fā)病率高達80％以上?；疾『蟪?dǎo)致牙周組織結(jié)構(gòu)破壞，牙周附著喪失、牙周袋形成、牙齒松動甚至脫落，是導(dǎo)致成年人失牙的主要原因。牙周病手術(shù)治療后，牙周組織的愈

3、合趨向于牙周各種細胞成分的競爭性生長，只有牙周膜細胞首先占據(jù)牙根面，才能形成真正意義的牙周組織再生；將體外培養(yǎng)的牙周膜細胞和牙齦成纖維細胞植入動物體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)牙齦成纖維細胞不能形成新的牙周再生所需的各種組織，多為纖維性愈合，而牙周膜細胞則可形成再生性愈合。本實驗采用體外原代培養(yǎng)人牙周膜細胞和牙齦成纖維細胞，四唑鹽比色法(MTT)比較二者的增殖特性、檢測堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性，免疫組化染色法對比兩

4、種細胞對于Ⅰ、Ⅲ型膠原、骨形成蛋白(bonemorphogenetic proteins,BMP)的表達情況，流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)比較兩種細胞中BMP水平的表達。 為深入研究牙周組織中各種細胞的生物學(xué)特性、進一步找出牙齦成纖維細胞和牙周膜細胞的鑒別標(biāo)志提供理論基礎(chǔ)，并為今后改良兩種細胞使其成為牙周組織工程的理想種子細胞奠定基礎(chǔ)。 方法：采用組織塊法分離培養(yǎng)牙周膜細胞和牙齦成纖維細胞，測定二者的

5、增殖特性和ALP活性，利用免疫組化和FCM方法比較Ⅰ、Ⅲ型膠原、BMP的表達情況，以觀察對比兩種細胞的生物學(xué)特性的異同。 1 原代培養(yǎng)及傳代體外人牙周膜細胞原代培養(yǎng)：取臨床上12歲左右因正畸需要拔除的健康前磨牙，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，利用組織塊法培養(yǎng)牙周膜細胞，當(dāng)細胞生長至鋪滿瓶底80％時進行傳代。取第二代細胞爬片，鑒定細胞來源。 體外人牙齦成纖維細胞原代培養(yǎng)：取同一個體同一部位的齦乳頭組織，按上述相同方法進行牙

6、齦成纖維細胞培養(yǎng)。 2 增殖活性的比較取第四代牙周膜細胞與牙齦成纖維細胞，以2×10<'4>/ml的細胞濃度接種于3個96孔培養(yǎng)板，10％DMEM(dulbecco’smodified eagle medium、)培養(yǎng)基共培養(yǎng)7 d，分別于第3、5、7d，各取出一個96孔板， MTT法于酶標(biāo)儀上492 nm波長讀取A值。 3 ALP活性比較取第五代牙周膜細胞與牙齦成纖維細胞，以1×10<'5>/ml的細胞濃度接種于24孔

7、培養(yǎng)板，10％DMEM培養(yǎng)基共培養(yǎng)7 d，棄孔內(nèi)液體，加入Triton X-100，4℃過夜，進行如下實驗：取上述各孔液體及空白對照的蒸餾水一并轉(zhuǎn)入另一96孔板。按ALP試劑盒說明依次按比例加入緩沖液、基質(zhì)液，水浴，加入顯色劑后在酶標(biāo)儀上于410 nm波長下測得OD值，間接反映細胞ALP活性。 4 免疫組化染色取第五、六代牙周膜細胞與牙齦成纖維細胞，以2×10<'5>/ml的細胞濃度接種于放有1×1cm<'2>大小蓋玻片的12孔

8、培養(yǎng)板中，加入10％DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)一周，95％乙醇固定后進行免疫組化染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。 結(jié)果判定：細胞胞漿中有棕色顆粒為陽性。以染色強度為判定標(biāo)準(zhǔn)，分為四級：無棕色顆粒記為(-)；僅有少量、細小、散在的棕色顆粒，著色較淺，記為(+)；棕色顆粒聚集成大顆粒記為(++)；顆粒密集成團片狀，著色深棕，記為(+++)。 5 流式細胞學(xué)檢測取第六代牙周膜細胞與牙齦成纖維細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化吹散，計數(shù)細胞量達1×10<'6

9、>個以上，離心收集細胞，D-Hank's液洗兩次，70％乙醇固定同時吹散成單細胞懸液，上機進行FCM檢測。 結(jié)果 1 人牙周膜細胞原代培養(yǎng)成功率為10％，牙齦成纖維細胞的原代培養(yǎng)成功率為100％，倒置相差顯微鏡下觀察，5～10 d有細胞從組織塊周圍游出，放射狀排列，20 d細胞長滿培養(yǎng)瓶底，原代及傳代培養(yǎng)的牙齦與牙周膜細胞在相差顯微鏡下形態(tài)相似，均為梭形，有2～3個胞漿突起，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯。經(jīng)免疫組化鑒定波

10、形蛋白陽性，細胞角蛋白陰性，符合成纖維樣細胞的特征。 2 加入MTT 4 h后，各孔內(nèi)均有紫黑色結(jié)晶形成，經(jīng)酶標(biāo)儀于492 nm處讀數(shù)，結(jié)果顯示牙齦成纖維細胞的A值明顯高于牙周膜細胞，P<0．01。 3 ALP檢測結(jié)果顯示，牙周膜細胞ALP的OD值高于牙齦成纖維細胞，P<0．01。 4 免疫組化染色：以陰性對照為參照，牙周膜細胞中I型膠原染色均為陽性，(++)～(+++)，胞漿中充滿棕黃色大顆粒，核膜周圍染色較深

11、，而牙齦成纖維細胞為(+)，染色較弱，顆粒細小，胞漿淡黃色。Ⅲ型膠原的染色結(jié)果牙周膜細胞為陽性，(++)～(+++)，牙齦成纖維細胞則著色較淡(+)。BMP在牙周膜細胞中深棕色顆粒密集成團片狀，為(+++)，而牙齦成纖維細胞著色較淡，為(+)。5流式細胞學(xué)檢測：牙周膜細胞中BMP的熒光強度值高于牙齦成纖維細胞，P<0．01。 結(jié)論 1 與牙周膜細胞相比，牙齦成纖維細胞取材容易，原代培養(yǎng)成功率高，細胞增殖活性強，進一步研究

12、后可作為牙周組織工程的種子細胞大量使用。 2 免疫組化染色顯示，Ⅰ、Ⅲ型膠原在體外培養(yǎng)的牙周膜細胞和牙齦成纖維細胞中的表達不同，牙周膜細胞表達均為中到強陽性，而牙齦成纖維細胞中為弱陽性，表明兩種細胞在膠原基質(zhì)合成方面存在差異。Ⅰ、Ⅲ型膠原可作為鑒別兩種細胞的標(biāo)志物。 3 牙周膜細胞表達的ALP活性高于牙齦成纖維細胞，免疫組化染色及FCM檢測均顯示牙周膜細胞的BMP表達高于牙齦成纖維細胞，ALP與BMP可作為鑒別兩種細胞的