結締組織生長因子(CTGF)對人牙周膜成纖維細胞生物學活性的影響.pdf

1、全世界牙周病的發(fā)病率約為10％～15％。最新結果統(tǒng)計顯示，在我國及日本30歲以上人群中有約80％人患牙周病[1]。牙周病成為35歲以上人群牙齒缺失的主要原因，并已成為多種慢性系統(tǒng)性疾?。ㄈ绻谛牟?、糖尿病等）發(fā)生、發(fā)展的危險因素，嚴重威脅著人類的健康[2]。牙周病治療的最終目標是重建因炎癥過程而破壞的牙周組織，恢復其正常的結構和功能，即真正實現(xiàn)牙周組織的再生。但因牙周病喪失的牙周組織，其重建與修復的難度很大。多年來，人們一直在尋求能有效增

2、加牙周新附著、促進牙周組織再生的方法，并開展了引導牙周組織再生、牙周骨移植技術等多方面的研究，取得了一定進展，但在恢復牙周組織的生理結構和功能上還遠遠未達到所期望的目標。近年來，組織工程、干細胞及其相關技術的發(fā)展突飛猛進，采用組織工程技術再生組織或者器官的研究也方興未艾，這為牙周組織再生研究提供了契機。組織工程學的研究重點主要在于以下三個方面:(1)種子細胞的來源;(2)生物載體支架材料的選擇;(3)有效的細胞因子。所以選擇有效的細胞因

3、子是運用組織工程技術獲得牙周再生的先決條件。
　　結締組織生長因子(CTGF)是近年來出現(xiàn)的一類促進組織修復的細胞生長因子，可以促進有絲分裂和細胞增殖，趨化細胞，誘導細胞黏附和細胞外基質的合成。已經在眼科、肝腎等學科中進行了深入研究，但在口腔科中很少涉及。牙周支持組織中也含有大量的纖維組織，牙周膜成纖維細胞是牙周組織中最重要的功能細胞，而CTGF與牙周組織的成纖維細胞的關系研究很少。
　　本課題選取人雙尖牙根中1/3的牙周膜

4、組織進行體外培養(yǎng)，通過組織塊培養(yǎng)法提取人牙周膜成纖維細胞，提取成功后用結締組織生長因子作用于成纖維細胞，觀察對其生物學活性的影響，從而為口腔科治療牙周病提供新的研究方向，為牙周病臨床藥物的研發(fā)提供新的生長因子。
　　目的:
　　體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細胞作為研究對象，觀察不同濃度的結締組織生長因子(CTGF)對人牙周膜成纖維細胞增殖、分化、黏附、遷移、合成細胞外基質的影響，探討不同濃度的結締組織生長因子(CTGF)對人牙周膜

5、成纖維細胞的生物學變化及其意義，為牙周組織再生的深入研究提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、在體外利用組織塊培養(yǎng)法分離純化人牙周膜成纖維細胞，倒置相差顯微鏡和蘇木素-伊紅染色觀察細胞形態(tài)，繪制細胞生長曲線，對細胞進行免疫細胞化學鑒定。
　　2、應用CCK-8方法檢測不同濃度的結締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)作用于人牙周膜成纖維細胞24、48、72h后增殖活性的影響。
　　3、應用堿性磷酸酶

6、試劑盒檢測不同濃度的結締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)對人牙周膜成纖維細胞堿性磷酸酶活性的影響。
　　4、應用羥脯氨酸試劑盒檢測不同濃度的結締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)對人牙周膜成纖維細胞合成膠原蛋白的影響。
　　5、應用茜素紅染色法檢測不同濃度的結締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)對人牙周膜成纖維細胞形成礦化結節(jié)能力的影響。
　　6、應用Transw

7、ell小室檢測不同濃度的結締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)對人牙周膜成纖維細胞遷移能力的影響。
　　7、應用實時定量PCR的方法檢測不同濃度的結締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)對人牙周膜成纖維細胞表達Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）、堿性磷酸酶(ALP)、纖維連接蛋白(FN)、骨涎蛋白(IBSP)、骨鈣素(OC)、整合素β1(ITGB1)mRNA水平的影響。
　　所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPS

8、S20.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)結果均以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，以P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、在體外采用組織塊培養(yǎng)法成功獲取人牙周膜成纖維細胞。細胞形態(tài)正常，形狀穩(wěn)定，狀態(tài)良好。免疫細胞化學染色波形絲蛋白陽性，角蛋白陰性，符合中胚層來源的間充質細胞的特征，證明培養(yǎng)的細胞是人牙周膜成纖維細胞。細胞生長曲線呈現(xiàn)“S”形。處于對數(shù)生長期的人牙周膜成纖維細胞，活性最佳，生長旺盛，最適合用于實驗研究。

9、本實驗取第4～6代細胞進行后續(xù)實驗。
　　2、與對照組相比，1、5、10ng/ml的CTGF在24、48、72h對人牙周膜成纖維細胞有明顯的促增殖作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而50ng/ml的CTGF與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，100ng/ml的CTGF則對人牙周膜成纖維細胞有抑制作用。兩兩比較顯示，不同濃度的CTGF刺激人牙周膜成纖維細胞增殖在三個不同的時間點之間，差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.0

10、5)。10ng/ml為促進人牙周膜成纖維細胞增殖的最佳濃度。
　　3、與對照組相比，1、5、10、50ng/ml的CTGF在7、14、28d對人牙周膜成纖維細胞有顯著增強ALP活性的作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，100ng/ml的CTGF則對人牙周膜成纖維細胞ALP活性有抑制作用。兩兩比較顯示，不同濃度的CTGF增強人牙周膜成纖維細胞堿性磷酸酶的活性在三個不同的時間點之間，差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。10ng/

11、ml的CTGF為促進人牙周膜成纖維細胞堿性磷酸酶活性的最佳濃度。
　　4、與對照組相比，1、5、10ng/ml的CTGF對人牙周膜成纖維細胞有顯著增強膠原蛋白合成的作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，50、100ng/ml的CTGF與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。10ng/ml的CTGF為促進人牙周膜成纖維細胞合成膠原蛋白的最佳濃度。
　　5、6個實驗組之間礦化率比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)

12、，與對照組相比，在質量濃度10ng/ml時，CTGF具有最大的促礦化作用(P＜0.01)。
　　6、1～100ng/ml的結締組織生長因子可以明顯促進人牙周膜成纖維細胞遷移，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。細胞遷移能力隨著結締組織生長因子(CTGF)濃度的增高而增加，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。
　　7、RT-PCR結果顯示，細胞ALP的mRNA表達水平，在CTGF濃度為5、10、50ng/ml時可以促進ALPmRNA的表達

13、，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在10ng/ml時達到最高峰。而1ng/ml和100ng/ml時與對照組相比差別不大。細胞IBSP的mRNA表達水平，在CTGF濃度為1、10、50、100ng/ml時可以促進IBSPmRNA的表達，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在10ng/ml時達到最高峰。而5ng/ml時與對照組相比差別不大。細胞OC的mRNA表達水平，在CTGF濃度為1、10、50ng/ml時

14、，可以促進OCmRNA的表達，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在10ng/ml時達到最高峰。而5ng/ml和100ng/ml時與對照組相比差別不大。細胞FN、COL-Ⅰ的mRNA表達水平，當CTGF在一定的濃度范圍(1～100ng/ml)內可以促進FN、COL-Ⅰ的mRN的表達，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在10ng/ml時達到最高峰。細胞ITGB1的mRNA表達水平，在CTGF濃度為1、5、10

15、、50ng/ml時可以促進ITGB1mRNA的表達，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在10ng/ml時達到最高峰。而100ng/ml時與對照組相比差別不大。
　　結論:
　　1、在體外采用組織塊培養(yǎng)法可以成功獲取人牙周膜成纖維細胞。該方法簡單易行，結果可靠，可以作為體外人牙周膜成纖維細胞實驗的研究模型。
　　2、結締組織生長因子作用于人牙周膜成纖維細胞以后，能夠提高人牙周成纖維細胞的活性，通過提高整合