外源性糖化成纖維細(xì)胞生長因子-2對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞體外生物學(xué)活性的影響研究.pdf

1、目的：據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，無論在臨床實(shí)驗(yàn)或糖尿病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都清楚顯示了血管新生能力下降和微血管功能受損，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境對(duì)維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性、促進(jìn)血管新生有重要作用的內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）數(shù)量和功能均有影響，使其數(shù)量減少且功能下降。而且糖尿病患者體內(nèi)高糖環(huán)境，能使還原性糖、醛基與各種蛋白質(zhì)N端游離氨基酸間添加聚合形成糖基化終末產(chǎn)物（AGEs），這種被糖基化的變形蛋白質(zhì)是毛細(xì)血管基底膜增厚、毛細(xì)血管受損的標(biāo)志，也是導(dǎo)致糖尿病患者大血

2、管及微血管并發(fā)癥的病因之一。在高糖環(huán)境中，除了大分子蛋白質(zhì)可發(fā)生糖化反應(yīng)外，參與細(xì)胞有絲分裂以及對(duì)EPC血管新生有重要促進(jìn)作用的成纖維細(xì)胞生長因子-2（FGF-2）也能同還原糖發(fā)生非酶的共價(jià)結(jié)合，形成糖化成纖維細(xì)胞生長因子-2（gFGF-2），而這種糖基化作用可能是使EPC功能失調(diào)，進(jìn)而影響血管新生的重要原因。因此本實(shí)驗(yàn)的研究目的在于，觀察外源性糖化成纖維細(xì)胞生長因子-2（gFGF-2）對(duì)大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）數(shù)量及體外生物學(xué)活性

3、的影響，探討gFGF-2對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管新生的影響。 方法：1.gFGF-2的制備及檢測(cè)：用PBS將FGF-2配成濃度為10 ug/ml的溶液，-70℃凍存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)前將FGF-2同250 mmol/L濃度的D-果糖于37℃共同培養(yǎng)48 h制備gFGF-2，用蛋白指紋圖譜分析儀檢測(cè)其糖化情況。2.骨髓EPC的分離、培養(yǎng)和鑒定：取大鼠骨髓，加PBS等倍稀釋并混勻。沿管壁緩慢加入裝有大鼠淋巴細(xì)胞分離液（1.083g/ml）的15ml

4、離心管中。2000r/min×25min密度梯度離心后將中間的白霧層吸出并置入另一短管中，加入5倍以上體積的M199，以1500 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞兩次。末次離心后，棄上清液，加入M199重懸細(xì)胞。以1×106/L的密度接種于加有M199完全培養(yǎng)液的預(yù)涂膠原的培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4d后換液，將未貼壁細(xì)胞棄之。倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)的EPC的形態(tài)、生長及增殖情況。將培養(yǎng)4d后的細(xì)

5、胞分組，分別以FGF-2（150 ng/ml）、gFGF-2（150 ng/ml）以及空白組繼續(xù)干預(yù)培養(yǎng)3d。用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色作CD34、CD133、VEGFR-2、ac-LDL和UEA-1檢測(cè)來鑒定EPC并計(jì)數(shù)。3.EPC體外功能的測(cè)定：胰酶消化培養(yǎng)7d的貼壁細(xì)胞，用血管生成試劑盒檢測(cè)其能力；收集7d的貼壁細(xì)胞作EPC黏附能力；用改良的Boyden小室作EPC遷移能力測(cè)定；MTT法測(cè)定EPC增殖能力；用放射性免疫法測(cè)定細(xì)胞

6、的培養(yǎng)液GM-CSF，EPO和IL-8的含量。 結(jié)果： 1.經(jīng)蛋白指紋圖譜分析，重組FGF-2分子質(zhì)量為16242.9 Da。然后將其同果糖共同培育48小時(shí)后其分子量出現(xiàn)增加，最大為17186.7 Da，將FGF-2成功糖化成gFGF-2。 2.骨髓來源的EPC在體外培養(yǎng)時(shí)呈梭形，貼壁生長，二者均表達(dá)CD34，CD133和VEGFR-2表達(dá)，且能結(jié)合UEA-1并攝取ac-LDL，證明所培養(yǎng)細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。且計(jì)數(shù)