力學(xué)環(huán)境對(duì)成纖維細(xì)胞生命活動(dòng)的影響——韌帶修復(fù)的力學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究.pdf

1、力學(xué)細(xì)胞生物學(xué)是生物工程中的一個(gè)主題，也是近代細(xì)胞生物力學(xué)的主流。它研究機(jī)械力如何調(diào)控組織的形態(tài)和功能，也研究組織是如何通過(guò)細(xì)胞生理學(xué)的變化對(duì)力學(xué)刺激進(jìn)行反饋。 根據(jù)美國(guó)國(guó)家工程院的定義，生物工程包括下列十二個(gè)方面：系統(tǒng)生理、生物物理、康復(fù)工程、生物力學(xué)、生物材料、生物傳感器、生物環(huán)境、生物圖像、論斷與治療方法、人工臟器、生物催化與反應(yīng)器、生化分離及純化、生化儀器與控制。其中，生物力學(xué)廣泛應(yīng)用于生物工程各方面，因?yàn)樯锝缰?，從?/p>

2、子到動(dòng)植個(gè)體無(wú)不服從力學(xué)規(guī)律。將傳統(tǒng)的力學(xué)方法與概念應(yīng)用于生物系統(tǒng)的觀察和解釋?zhuān)褪巧锪W(xué)。生物力學(xué)的發(fā)展，解答了許多原來(lái)存疑的生命奧秘。 由于生物醫(yī)學(xué)研究日新月異的發(fā)展和生命系統(tǒng)的高度復(fù)雜性，諸如動(dòng)態(tài)的新陳代謝機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信息接受轉(zhuǎn)換與激化機(jī)制以及生理學(xué)、遺傳學(xué)，適應(yīng)和基因調(diào)控的力學(xué)關(guān)系等，都難以用傳統(tǒng)生物力學(xué)手段來(lái)觀察及闡明。 研究力學(xué)環(huán)境（刺激）對(duì)人類(lèi)健康、疾病或損傷的影響，闡明其機(jī)制，進(jìn)而發(fā)展出治療的新路

3、途、新技術(shù)、新醫(yī)藥，這些都是現(xiàn)代生物力學(xué)所期待的。 本研究論文以人的前交叉韌帶(ACL)和內(nèi)側(cè)副韌帶（MCL）的成纖維細(xì)胞物理性質(zhì)的改變、受力及變化為主軸，從傳統(tǒng)的力學(xué)分析、細(xì)胞受力后的應(yīng)答以及對(duì)力學(xué)刺激的反饋等方面進(jìn)行深入研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討損傷后無(wú)法自然愈合的前交叉韌帶的修復(fù)機(jī)制。本論文實(shí)驗(yàn)共分四部份（第二、三、四、五章）。 第一部份（第二章）：研究人韌帶成纖維細(xì)胞對(duì)膠原Ⅰ型和膠原Ⅲ型黏附強(qiáng)度的差異以及信號(hào)通

4、路對(duì)ACL和MCL成纖維細(xì)胞黏附纖維結(jié)合基質(zhì)蛋白的影響。在韌帶損傷后新的結(jié)締組織形成之前的炎癥性過(guò)程中，韌帶成纖維細(xì)胞嵌入韌帶愈合組織基質(zhì)，遷移進(jìn)入損傷部位。遷移過(guò)程中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性對(duì)細(xì)胞黏附細(xì)胞外基質(zhì)蛋白有重大影響。ACL和MCL成纖維細(xì)胞對(duì)膠原Ⅰ型和膠原Ⅲ型的黏附機(jī)制揭示了細(xì)胞對(duì)損傷修復(fù)過(guò)程應(yīng)答的行為。膠原Ⅰ型和膠原Ⅲ型是兩種原纖維膠原，由ACL和MCL成纖維細(xì)胞分泌并在細(xì)胞外空間裝配成長(zhǎng)的電纜狀的原纖維。膠原Ⅰ型和膠原Ⅲ型是構(gòu)成ACL

5、和MCL兩種韌帶的主要結(jié)構(gòu)蛋白。本研究通過(guò)微量吸管抽吸技術(shù)測(cè)定ACL和MCL成纖維細(xì)胞從由膠原Ⅰ型和膠原Ⅲ型構(gòu)成的基質(zhì)上分離下來(lái)所需要的力。我們測(cè)定了來(lái)自于ACL的約1，200個(gè)成纖維細(xì)胞和來(lái)自于MCL的約1，600個(gè)成纖維細(xì)胞的黏附強(qiáng)度（黏附力/黏附單位）。我們還研究了ACL 和 MCL成纖維細(xì)胞黏附纖維結(jié)合蛋白（基質(zhì)的一種黏附蛋白）中的信號(hào)通路，其中重點(diǎn)研究了環(huán)磷酸腺苷和Ca2+/磷脂通路，以明確在細(xì)胞結(jié)合/黏附和鋪展在纖維結(jié)合蛋白

6、表襯的表面過(guò)程中整合受體介導(dǎo)的信號(hào)。用信號(hào)通路樹(shù)狀抑制因子處理細(xì)胞后，測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的黏附強(qiáng)度。用帶有定量熒光系統(tǒng)（Image-1/F軟件）和硅增強(qiáng)器靶管（Hamamatsu光學(xué)電子設(shè)備）的Fura-2（鈣離子選擇熒光探針）研究細(xì)胞內(nèi)鈣的分布，基于這個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，確定細(xì)胞內(nèi)鈣在ACL和MCL間整聯(lián)介導(dǎo)的黏附中的作用。結(jié)果MCL成纖維細(xì)胞在細(xì)胞溶質(zhì)游離鈣中對(duì)纖維結(jié)合蛋白的結(jié)合增強(qiáng)2.2倍，而ACL成纖維細(xì)胞在鈣中無(wú)明顯變化。 第二部份

7、（第三章）：-通過(guò)電穿孔技術(shù)向ACL和MCL成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)入放射整聯(lián)橋接蛋白抑制因子（踝蛋白、粘著斑蛋白和a-輔肌動(dòng)蛋白）后，兩種細(xì)胞表現(xiàn)出不同的黏附力，這種抑制因子可以顯著減弱ACL和MCL細(xì)胞的黏附，同時(shí)可以降低張力絲的形成和細(xì)胞延伸率。分別用細(xì)胞松弛素D和秋水仙堿阻斷肌動(dòng)蛋白絲和微管的裝配后，也可以顯著減弱ACL/MCL細(xì)胞的黏附性。ACL和MCL成纖維細(xì)胞的黏附都依賴(lài)細(xì)胞骨架裝配，然而，在許多方面,ACL和MCL對(duì)細(xì)胞骨架裝配的

8、依賴(lài)性是不同的，特別是對(duì)原肌球調(diào)節(jié)蛋白（在肌動(dòng)蛋白絲的自由端或尖端發(fā)現(xiàn)的一種成帽狀蛋白），外源性原肌球調(diào)節(jié)蛋白釋放后，MCL黏附出現(xiàn)增強(qiáng)。一般說(shuō)來(lái)，韌帶細(xì)胞黏附依賴(lài)（1）肌動(dòng)蛋白絲裝配/張力絲形成，它們可以影響整聯(lián)蛋白的空間分布；（2）放射整聯(lián)橋接蛋白的功能，它能影響整聯(lián)蛋白構(gòu)形變化。所有這些調(diào)節(jié)因素對(duì)細(xì)胞黏附性都有重大影響。 第三部份（第四章A、B）：主要研究炎癥條件下韌帶細(xì)胞的遷移，增殖和愈合。經(jīng)過(guò)出血、炎癥、增殖和組織重建

9、這個(gè)有序的過(guò)程后，韌帶開(kāi)始愈合。在細(xì)胞水平上，愈合包括細(xì)胞的脫離，對(duì)傷口周?chē)|(zhì)的黏附，遷移和增殖。本部分研究的目的是確定在相同的炎癥條件下，ACL和MCL成纖維細(xì)胞的遷移和應(yīng)答是否存在本質(zhì)區(qū)別。我們?cè)O(shè)計(jì)了兩組實(shí)驗(yàn)，一組是制造各種寬度的創(chuàng)口（通過(guò)用接種環(huán)在融合的細(xì)胞層上制造無(wú)細(xì)胞區(qū)域來(lái)模擬體外創(chuàng)傷），使細(xì)胞可以遷移到這個(gè)無(wú)細(xì)胞缺口區(qū)域，另一組是添加炎癥因子(TNF-a, C5a和脂多糖)。隨著傷口的寬度增加，兩種類(lèi)型的韌帶細(xì)胞的恢復(fù)率都

10、下降（ACL的斜面為0.13 hr/μm而 MCL的斜面為 0.10 hr/μm）。使用三種炎癥因子都能降低兩種韌帶細(xì)胞的恢復(fù)率，愈合速度比對(duì)照組慢1.4～2.3倍。然而，在兩組實(shí)驗(yàn)中，ACL成纖維細(xì)胞對(duì)炎癥因子的更為敏感，MCL細(xì)胞的恢復(fù)率更高（快1.2～3.4倍）。 第四部份（第五章）： 通過(guò)使用切削刃研究開(kāi)發(fā)一種基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）抑制因子雞尾酒式療法來(lái)幫助損傷ACL愈合，減少將來(lái)用韌帶組織移植進(jìn)行的ACL重建。由于

11、ACL缺乏足夠的愈合應(yīng)答，盡管采用了各種方法修補(bǔ)損傷后ACL的重建功能，并多年來(lái)沿用這種方法，但效果很不理想，包括同種異體移植，異種移植和自體移植。后來(lái)，也采用來(lái)自于髕韌帶、髂脛帶、半腱肌和股薄肌腱的組織。然而，從這些器官獲得的組織供體部位的強(qiáng)度和功能的不一致，可能會(huì)導(dǎo)致次級(jí)并發(fā)癥。并且衰退的ACL重建花費(fèi)昂貴，還需要進(jìn)行復(fù)雜的外科手術(shù)。在過(guò)去的十年中，我們實(shí)驗(yàn)室證明了ACL和MCL在細(xì)胞水平和分子水平上存在一些本質(zhì)的區(qū)別。實(shí)驗(yàn)初步研究

12、證明了基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9在ACL和MCL上的活動(dòng)對(duì)分子和細(xì)胞過(guò)程產(chǎn)生不利影響，這些過(guò)程包括基質(zhì)消化、組織重建和組織再生。本部分研究聚焦于炎癥和生長(zhǎng)因子作用下，在細(xì)胞水平（體外），組織水平（體外）和動(dòng)物模型水平（體外）上MMP家族蛋白對(duì)ACL基質(zhì)的重建和愈合的影響。 我們發(fā)現(xiàn)MMPs的過(guò)度表達(dá)是ACL損傷后無(wú)法自然愈合的重要原因。通過(guò)減弱MMPs分子表達(dá)和破壞它的平衡是改進(jìn)組織再生和重建能力，促進(jìn)傷口愈合

13、和增強(qiáng)ACL生理強(qiáng)度的有效方法。這一前沿的研究工作是工程學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的交叉融合，是在體外從細(xì)胞、分子水平上對(duì)生物體細(xì)胞、組織和器官的研究。 本論文的系列研究主要探索了力學(xué)環(huán)境對(duì)成纖維細(xì)胞生命活動(dòng)的影響及調(diào)控。研究目的是闡明韌帶損傷后的力學(xué)過(guò)程與生物學(xué)過(guò)程，如重建、適應(yīng)性變化、修復(fù)機(jī)制和基因調(diào)控之間的相互關(guān)系，從而發(fā)展出一個(gè)新的方法，以解決前交叉韌帶損傷后無(wú)法自然愈合的醫(yī)學(xué)難題。研究結(jié)果解釋了ACL成纖維細(xì)胞與MCL成纖維細(xì)胞